Chromosomenpräparation

:: geschichtlicher Überblick ::

1874 (Arnold), 1881 (Fleming): erste Beobachtung menschlicher Chromosomen

1952 (Hsu) Durch einen Präparationsfehler (hypotone Behandlung) wird die erste Beschreibung des menschlichen Chromosomensatzes möglich (allerdings noch unter der Annahme, es wären 48 Chromosomen)

1956 (Tjio + Levan) Humaner Chromosomensatz besteht aus 46 Chromosomen

60er Jahre: Definition der Karyotypen für Down-Syndrom, Turner u. a. Trisomien
Die Chromosomen konnten zu der Zeit aber nur einheitlich angefärbt werden (Giemsa, Feulgen, Orcein), so daß eine Einteilung nur nach Größe und Lage des Zentromers (meta-, submeta-, akrozentrisch) in die 6 Gruppen A-G möglich war.

1970 (Caspersson + Zech) erste Bänderung (Quinakrin) macht eine individuelle Unterscheidung der Chromosomen ab da möglich.

Chromosomenpräparation

Traditionell werden die Metaphasechromosomen in der Mutagenitätstestung auf Schäden hin untersucht. Auch in der Karyotypdiagnostik (z.B. Fruchtwasseruntersuchung, Tumorzytogenetik) hat die Chromosomenuntersuchung einen hohen Stellenwert.

Chromosomenuntersuchungen sind allerdings sehr zeitaufwendig (besonders, wenn durch die zytotoxische Wirkung einer Substanz nicht mehr viele Metaphasen zur Auswertung vorhanden sind) und setzen zudem ein hohes Maß an Sachkenntnis voraus, wenn es darum geht, gebänderte Chromosomen genau zu karyotypisieren. 

Colchizin

Zellgift, Spindelgift

Colchizin ist ein Alkaloid der Herbstzeitlosen. Es verursacht das Absterben der Spindelfasern, wodurch das Auseinanderweichen der Schwester-Chromatiden verhindert wird.
Zusätzlich bewirkt es ein Kondensieren des Chromatins.


hypotone Lösung

Das Chromatin wird mittels einer hypotonen Lösung zum Quellen gebracht (Prinzip der Osmose).


Fixierung

Bei formalinfixierten Zellen ist keine Chromosomenbänderung sichtbar. Deshalb wird in der Zytogenetik mit einem Essigsäure-Methanol-Gemisch fixiert.

 

:: Chromosomenpräparation ::

Probenmaterial

Die Darstellung von Chromosomen ist aus allen teilungsfähigen Geweben möglich. Chromosomen können aus diversem Probenmaterial präpariert werden, z.B. Peripheres Blut, Gewebe (Fibroblasten), Fruchtwasser, Chorionzotten, Knochenmark.

· Knochenmark (KM)
Vorteil: Die Zellen teilen sich dort kontinuierlich, ohne dass eine Stimulation nötig wäre. Durch eine kurze Kultivierung von wenigen Stunden lässt sich der Mitoseindex erhöhen.
Nachteil: Die Entnahme ist schwierig. Der Mitoseindex ist - besonders verglichen mit dem im Blut - sehr gering. Zudem sind die Chromosomen von schlechter Qualität, d.h. stark kondensiert und daher kurz und "verschrumpelt", die Morphologie ist oft diffus, außerdem sind diese Chromosomen für verschiedene Vorbehandlungen bei den Färbungen (z.B. Trypsinierung) sensibler, so dass für Blut bestehende Protokolle variiert werden müssen.

· Hautbiopsie:
Problem der Entnahme (Wunde schneiden: blutig, muss ev. auch genäht werden), Kontaminationsprobleme, da Entnahme nie vollständig steril erfolgen kann. Kultur muss erst über viele Tage angezüchtet werden. Macht man nur in Ausnahmefällen.

· Peripheres Blut
Lymphozyten aus peripherem Blut eignen sich am besten zur Chromosomendarstellung, weil die Entnahme von venösem Blut einfach und die Mitoseausbeute bei der Kultivierung sehr gut ist. Da sich die im Blut befindlichen Lymphozyten normalerweise aber nicht teilen, müssen sie in der Kultur durch ein Mitogen zur Teilung stimuliert werden.

Die Präparationstechniken unterscheiden sich von Labor zu Labor, das Grundprinzip allerdings ist immer das gleiche.

Methode

· Anlegen einer Kultur mit dem speziellen Kulturmedium und in einem dafür geeigneten Kulturbehältnis
· Kulturdauer abwarten - ev. Wechsel des Kulturmediums und Kontrolle der Mitosenanzahl
· Stoppen des Wachstums ("Unterbrechen" oder "Ernten" genannt) mittels Colchizin (Spindelgift)
· hypotone Lösung
· Fixierung mit einem Essigsäure-Methanol-Gemisch
· ev. Aufbringen der Zellen auf einen Objektträger
· Färben der Präparate

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:: Quellenangabe

· The AGT Cytogenetics Laboratory Manual

 Autor: M.J. Barch, T. Knutsen, J.L. Spurbeck
Jahr: 3. Auflage
Verlag: Lippincott-Raven
ISBN 0-397-51651-7