Altern und Färben

:: Altern der Objektträger

· Prinzip:

Damit eine gute Bänderung der Chromosomen erreicht wird, ist der Alterungsprozess sehr wichtig. Der Grund dürfte sein, dass die Präparate noch weiter trocknen und überschüssiges Wasser verdunstet.
Dieser Effekt darf nur für eine gewisse Zeit betrieben werden - "ausgedörrte" Chromosomen lassen sich kaum noch bändern.

· Tipps:

Ideale Alterungszeiten:

3 bis 4 Tage bei Raumtemperatur
12-24 Stunden bei 40-60°C im Brutschrank oder Ofen (über Nacht ist ausreichend)
1-2 Stunden bei 75°C (Heizplatte)
20 Minuten bei 90-95°C (Brutschrank oder Ofen)

Präparate für FISH allerdings sind besser geeignet, wenn man sie sofort nach der Erstellung einfriert (flüssiger Stickstoff).

Index

:: Alterungsprozess
:: Q-Banding
:: G-Banding
:: R/C-Banding
:: C-Banding
:: Entfärben
:: Eindecken
:: Quellenangabe

:: Q-Banding

· QFQ (Quinacrine Banding)

Q-Bänding ist keine übliche Routinefärbung. Sie stellt vielmehr eine zusätzliche Färbemethode dar, die zuverlässig eine Identifikation spezifischer Chromosomen und struktureller Veränderungen erlaubt.

Die Bänderung mit dem Fluoreszenzfarbstoff Quinacrine war 1970 die erste Bänderungsfärbung, die eine individuelle Unterscheidung der Chromosomen ermöglichte. Mit der Q-Bänderung leuchten bestimmte polymorphe Regionen (perizentromerische Regionen an den Chromosomen 3 und 4, variable Regionen im Zentromer und den Satellitenregionen von Chromosomen der Gruppen D, E und G sowie der Heterochromatinblock im langen Arm von Chromosom Y) hell auf.

Die helle Fluoreszenz findet sich dabei in DNA-Abschnitten mit AT-reichen Basenpaaren. Das kommt daher, weil AT-reiche DNA die Quinacrine-Fluoreszenz steigert, CG-reiche DNA sie dagegen vermindert ("quencht"). Weiters spielen bei dieser Färbung auch die Variation der Basenzusammensetzung entlang der gesamten Länge des Chromosoms und DNA-Protein-Wechselwirkungen eine Rolle.

Quinacrine ist nützlich zur Unterscheidung des Y-Chromosom. Sogar in den Interphasezellen wird mit der Q-Bänderung der distale Heterochromatinblock des Y-Chromosoms als F-Body sichtbar, wodurch das Kerngeschlecht auch ohne Chromosomenkultivierung bestimmbar wird und somit auch ein Vaterschaftsnachweis ermöglicht wird.

Darüber hinaus kann die Q-Bänderung manchmal nützlich sein zur Identifikation von
· mütterlichen Zellen versus fetalen Zellen
· Spender versus Empfänger
· vererbte chromosomale Varianten

Die Quinacrine-Färbung wird mittels eines Floureszenzmikroskops begutachtet. Dazu ist die richtige Filterwahl wichtig:
· Absorptions-Maximum bei 455 nm
· Emissions-Maximum bei 495 nm

Färbung

Variationen in der Farbstoffkonzentration und Färbezeit sind bei der Standardfärbung von Quinacrine weniger kritisch als bei anderen Färbungen. Dennoch sollte folgendes beachtet werden:

· Überfärbung bewirkt Hintergrund und ein Flackern um die Zellen
· zu langes Spülen wäscht die Färbung wieder aus
· ein Puffer, der zu hypoton ist, lässt die Chromosomen anschwellen
· ein falscher pH-Wert vermindert den Kontrast

Vor dem Eindecken werden die Präparate kurz in McIlvaine's Puffer gestellt, der einen pH-Wert zwischen 4,5 und 5,5 haben sollte. Ein pH-Wert bei 5,5 erhöht die Helligkeit, ein pH-Wert bei 4,5 erhöht den Bandenkontrast.
Für alte Präparate ist manchmal ein pH-Wert bei 4,3 besser geeignet.

ACHTUNG: Quinacrine gilt als carcinogen - daher unbedingt Handschuhe tragen.

Objektträger, die Quinacrine gebändert sind, können entfärbt und mit anderen Methoden gefärbt werden.

:: Metaphase Q-Banding ::    :: Karyogramm Q-Banding ::

:: Die Beispielbilder wurden mit freundlicher Genehmigung von der Genetischen Beratungsstelle des Wilhelminenspital, Wien dem Zytogenetik Forum zur Verfügung gestellt

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:: G-Banding

· GTG - Giemsa-Banding mit Trypsin
· GTW - Giemsa-Trypsin-Banding mit Wright's Färbung
· GAG (ASG) - Giemsa-Banding mit 2xSSC (Acetic Saline)

G-Banding ist eine Steigerung des normalen Chromosomenmusters von meiotischen Chromosomen.

Chromatin wird in zwei Hauptgruppen unterteilt: Heterochromatin und Euchromatin.
Konstitutives Heterochromatin ist stark kondensiert (verdichtet), wiederholt sich oftmalig und ist während der Interphase transkriptorisch inaktiv.
Euchromatin dekondensiert während der Interphase, damit eine Gentranskription stattfinden kann.

Die Chromatinstruktur und -funktion variiert entlang der Chromosomenarme. Mittels Färbetechnik (Bänderung) kann die Basenabfolge und der Zeitpunkt der DNA-Replikation dargestellt werden.

Positive G-Bänder sind AT-reich und CG-arm.
Das bedeutet: Dunkle G-Bänder sind CG-arm, helle G-Bänder sind CG-reich.

· Trypsin-Behandlung:

Um eine optimale Trypsin-G-Bänderung zu erhalten, sollten die Regeln über ideal gespreitete Metaphasen (siehe dazu :: Auftropfen ::) und die richtige Alterungstechnik (siehe dazu oben :: Altern ::) beachtet werden.

Zuerst sollte immer ein Objektträger zur Probe gefärbt werden, um die Bänderung beurteilen zu können. Es können Aussagen getroffen werden zu:

· Länge der Trypsin-Behandlung
· Trypsinkonzentration und -aktivität
· Giemsafärbung

Untertrypsiniert - undeutliche Bänder, wenig Kontrast, ausgefranste Ränder
Übertrypsiniert - scharfe Bänder, ausgefranste Enden, zuviel Kontrast, blasse Telomere
Extrem übertrypsiniert - Chromosomen sind hellgrau, wirken geisterhaft und aufgebläht

Länge der Trypsin-Behandlung in 2 Sekunden-Abständen steigern oder vermindern, Länge der Giemsafärbung in 5 Sekunden-Abständen ändern.

Am besten kontrolliert man bestimmte Chromosomen, um die Trypsin-Färbung zu beurteilen.
· Kontrolle der Chromosomen 2, 4 und 6 - auf Abgrenzung der dunklen Bänder achten
· Kontrolle der Chromosomen 1, 7, 11, 17 und 19 - auf Kontrast achten

Trypsin wird zumeist als Stammlösung hergestellt und aliquotiert. Die Gebrauchslösung hat bei niedrigeren Temperaturen eine verminderte Aktivität. Erhöhen des ph-Wertes (z.B. auf 8) und Erhöhen der Temperatur steigert die enzymatische Aktivität von Trypsin - das macht Sinn, wenn die Zellen auf die übliche Trypsinkonzentration resistent reagieren.
Senken der Temperatur vermindert die Trypsin-Aktivität.

Nach der Trypsin-Behandlung werden die Chromosomenpräparate in Fetalem Kälberserum gespült, um die Trypsin-Aktivität zu stoppen. Das Serum enthält a1-Antitrypsin, welches die andauende Wirkung von Trypsin hemmt.

:: Metaphase GTG-Banding ::

:: Das Beispielbild wurde mit freundlicher Genehmigung vom Zytogenetischen Labor des CCRI St.Anna Kinderspital, Wien dem Zytogenetik Forum zur Verfügung gestellt

· Wright's Färbung:

bewirkt schärfere Auflösung und feinere Bänder
Gut geeignet für High Resolution Banding, aber auch für in situ Kulturen, wo störender zytoplasmatischer Hintergrund zu erwarten ist.

· SSC-Behandlung:

über Nacht bei 60°C im Brutschrank

Für das GAG-Banding mit 2xSSC ist es besonders wichtig, dass die Präparate gut getrocknet (gealtert) sind. In unserem Labor wurde vielfach beobachtet, dass Glasobjektträger von Chorionzottendirektkulturen nach einer zu kurzen Trocknungszeit (2 Stunden bei 60°C) in Verbindung mit SSC einen kristallinen Niederschlag bilden, der sämtliche Chromosomen überdeckt.

Die ideale Trocknungszeit für Direktkulturen liegt erfahrungsgemäß bei 2 Stunden bei 70°C auf der Heizplatte.

Die anschließende Giemsafärbung folgt direkt auf die feuchten Präparate bzw. nach einem Abspülen des SSC in Aqua dest.

:: Karyogramm GAG-Banding ::

:: Das Beispielbild wurde mit freundlicher Genehmigung vom Humangenetischen Labor des Donauspital, Wien dem Zytogenetik Forum zur Verfügung gestellt

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:: R/C-Banding

3-Farbstofffärbung nach Schweizer

Die simultane R/C-Bänderung wird mit DNA-Fluoreszenzfarbstoffen durchgeführt (giftig!). Zur Darstellung ist jeweils ein Filter mit einer Wellenlänge von 360-370nm (DA-DAPI) und 435-470nm (Chromomycin) erforderlich.

Zur R/C-Bänderung können frisch aufgetropfte trockene Präparate verwendet werden, bzw. die Präparate, die für die Übersichtsbeurteilung Giemsa gefärbt wurden. Diese Slides müssen zuvor in Eisessig-Methanolgemisch 1:4 mindestens 30 Minuten entfärbt und getrocknet werden. Damit die OT auch wirklich trocken sind, können sie unter einem warmen Händetrockner im Luftstrom kurz getrocknet (gealtert) werden. Diese Methode hat sich auch für FISH bewährt.

Das Chromomycin A3 sollte nicht frisch gelöst sein und ist im Kühlschrank lichtgeschützt lange Zeit haltbar.

Distamycin (DA) und DAPI werden portioniert in der gewünschten Verdünnung eingefroren.

In drei Färbeschritten werden die Objektträger sowohl mit Chromomycin, Distamycin und als letzten Schritt mit DAPI lichtgeschützt gefärbt. Eingedeckt wird in McIlvaines Puffer mit MgCl 1:1 mit Glyzerin. Die eingedeckten Präparate werden vorsichtig zwischen Filterpapier ausgedrückt, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Anschließend wird das Deckglas mit Rubberzement luftdicht verschlossen.

Der Vorteil: Der Rubberzement lässt sich mühelos wieder entfernen und ermöglicht ein neuerliches Entfärben, falls an einem der Präparate eine FISH durchgeführt werden soll. Anhand der Koordinaten der Metaphasen kann diese wiedergefunden und mit dem Ergebnis der Sonde verglichen werden.

Die Präparate können in den meisten Fällen sofort nach der Färbung abgesucht werden, das heißt, dass im günstigen Fall bereits nach 24 Stunden ein Befund erstellt werden kann, was für die Leukämiediagnostik sehr wichtig ist.
Schlechte Bänderung kann verschiedene Ursachen haben und kann durch eine vorangegangene Antibiotikatherapie induziert sein. Meist lässt sich dieses Problem durch eine 1-3 Tage dauernde Lagerung beheben, jedoch ist schlechte Färbequalität eher ein sehr seltenes Ereignis bei de novo Leukämien.
Ebenso ist es möglich, daß die R-Bänder sehr schnell verblassen (Fading). Dem kann mit dem Einsatz von Antifadingpuffer entgegengewirkt werden.

Diagnostik:

Im für DA-DAPI geeigneten Filter wird der Objektträger abgesucht, und angeregt durch den jeweiligen Filter wird jeweils ein Bild der reversen R-Bande (Chromomycin), als auch der C-Bande (DA-DAPI) aufgenommen.
Der Vorteil diese Färbemethode ist, daß man von jeder Mitose zwei Bilder mit unterschiedlichem Bandenmuster hat und so die Zuordnung bei komplexen Karyotypveränderungen sehr erleichtert wird.

Lagerung: Im Kühlschrank sind die R/C-gebänderten Präparate einige Jahre haltbar.

:: Metaphase Chromomycin ::    :: Metaphase DA-DAPI ::    :: R/C Karyogramm ::

:: Ich danke Frau Helga Grüner vom Genetischen Labor des Hanuschkrankenhauses für diesen Beitrag. Die Beispielbilder wurden mit freundlicher Genehmigung von Frau Grüner dem Zytogenetik Forum zur Verfügung gestellt.

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:: C-Banding

Konstitutives Heterochromatin bildet annähernd 20% des menschliches Genoms. Es ist rund um die primäre Einschnürung (Zentromerregion) aller humanoider Chromosomen lokalisiert, und ist reichlich vorhanden an der sekundären Einschnürung der Chromosomen 1, 9, 16 und im langen Arm von Chromosom Y.

Eigenschaften von konstitutivem Heterochromatin:

· allgegenwärtig
· heteropyknotisch
· reproduziert sich erst recht spät
· enthält highly repeated satellite and non-satellite DNA-Sequenzen
· enthält wenig, wenn überhaupt, strukturelle Gene
· ist höchst polymorph
· wird vermutlich nie transkribiert

Die Menge, Stabilität und evolutionäre Erhaltung des konstitutiven Heterochromatins lässt vermuten, dass es funktionell gesehen eine wichtige Rolle spielt. Der Schlüssel zu seiner Funktion mag in seiner Positon (üblicherweise im Zentromer) und seiner Anordnung (üblichweiser große Mengen von verhältnismäßig kurz hintereinander gereihten Wiederholungen) liegen.

Konstitutives Heterochromatin wird mittels C-Band-Technik visualisiert (nicht möglich bei fakultativem Heterochromatin).

Mechanismus

Die C-Banden resultieren daraus, dass aus den C-Band-negativen Regionen durch die HCl-Behandlung mehr DNA und Proteine herausgelöst werden als in den positiven. Besonders spielt dabei aber der DNA-Verlust eine Rolle, weil Giemsa die DNA anfärbt. Das Heterochromatin (C-Band-positiv) ist mit Proteinen dichter bepackt und enthält darüber hinaus noch spezielle Nicht-Histonproteine. Durch die stärkere Proteinbindungen (bewirkt durch die hochrepetitive DNA) wird die DNA in den C-Band-positiven Regionen langsamer depuriniert. Ein Verlust von DNA und Protein ist dadurch erschwert, deshalb färben sich diese Bereiche dunkler an.

Indikationen

Die C-Bänderung erlaubt keine individuelle Unterscheidung der Chromosomen. Es wird das zentromernahe Heterochromatin aller Chromosomen angefärbt, besonders deutlich tritt dies am perizentromerischen Heterochromatinblock der Chromosomen 1, 9 und 16 sowie am distalen Heterochromatinblock des Y zu Tage, weswegen diese Chromosomen mit dieser Bänderung identifiziert werden können.

Die C-Banding-Methode wird verwendet, um polymorphe Varianten (üblicherweise Normvarianten) in diesen Chromosomen zu identifizieren:
· Verkürzungen oder Vermehrungen in der Länge der heterochromatischen Regionen (1qh, 9qh, 16qh, Yqh)
· Inversionen in Chromosom 9

Eine Verminderung genauso wie ein prominenter Zugewinn an Heterochromatin in diesen Regionen kann häufig der Fall sein, ohne pathologische Auswirkungen auf den Träger zu haben. Da solche Polymorphismen vererbt werden, lassen sie sich gut zum Vaterschaftsnachweis (Ausschlussverfahren) verwenden.

Die Technik kann auch verwendet werden, um überzählige Chromsomen bzw. Markerchromosomen zu identifizieren.

Die qh-Regionen von Chromosom 1, 9 und 16 werden an der durchschnittlichen Größe des kurzen Armes von Chromosom 16 gemessen:
· der kurze Arm von Chromosom 16 verkürzt sich bei Kontraktionen kaum und ist daher ein stabiler Messfaktor
· das Zentromer von Chromosom 16 kann leicht identifiziert werden
· Chromosom 16 selbst kann leicht im C-Band erkannt werden

Färbung:

Eine optimale C-Bandfärbung erreicht man mit Präparaten, die ein paar Tage gealtert sind. Frisch präparierte Objektträger tendieren dazu, ein G-Band ähnliches Bandenmuster zu zeigen, und die Chromosomen sind ausgefranst.

Die Barium Hydroxid-Behandlung denaturiert die DNA der Chromosomen, ebenso wie Hitze. Die ideale Temperatur liegt bei 50°C, Länge 20 Minuten.

· zu kurze Inkubation in Ba(OH)2 resultiert in komplettem G-Band-artigem Muster
· exzessive Behandlung mit Ba(OH)2 bewirkt geisterhafte, aufgeblähte Chromosomen

Barium Hydroxid löst sich in Wasser am besten bei 60-65°C, danach filtrieren um Niederschläge zu vermeiden

Anschließend folgt 1 Stunde (Glasobjektträger) bzw. über Nacht (Kunststoff-Slides) in 2xSSC bei 60-65°C , danach eine Giemsafärbung.

:: Metaphase C-Banding ::

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:: Entfärben

Methode 1

3:1 Methanol-Essigsäure-Gemisch - 5 min
Methanol - 5 min
lufttrocknen

Methode 2

100% Alkohol
95% Alkohol
70% Alkohol
Aqua dest

Diese beiden Methoden entfärben Giemsa, Quinacrine und DAPI. Nicht geeignet für C-Banding.

Methode 3 (für Wrights Stain)

95% Alkohol - 2 min
Chloroform - 15 sek
95% Alkohol mit 6N HCl - 30 sek
100% Methanol - 2 min
lufttrocknen

Vor dem Entfärben bei allen Methoden zuvor Öl und Eindeckmittel entfernen (mit Xylol) und Präparate gut trocknen lassen.

Methode 4 (für C-Banding)

2xSSC - 60°C

damit wird der Giemsafarbstoff entfernt, nicht die Barium Hydroxid-Reaktion

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:: Eindecken

· Eindecken - Ja:

- Der Objektträger ist vor Zerkratzen geschützt.
- Immersionsöl wirkt (direkt auf den gefärbten Objektträger aufgebracht) entfärbend und verschlechtert die Erscheinung der Chromosomen nach ein paar Stunden (sofortiges Entölen mit Xylol ist wichtig).
- Immersionsöl direkt auf die Zellen aufgebracht stört eine anschließende FISH-Färbung - solche Objektträger müssen eine längere Zeit mit Xylol gespült werden

· Eindecken - Nein:

- Mehrere Färbemethoden auf ein und demselben Objektträger, der dazwischen entfärbt werden muss, sind schnell und problemlos möglich.
- Manche Eindeckmittel verschlechtern die Qualität der Zellen für eine FISH, die auf demselben Objektträger angeschlossen werden muss.

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:: Quellenangabe

· The AGT Cytogenetics Laboratory Manual

Autor: M.J. Barch, T. Knutsen, J.L. Spurbeck
Jahr: 3. Auflage
Verlag: Lippincott-Raven
ISBN 0-397-51651-7