Erstellen von Präparaten

:: Chromosomenpräparate aus der  Zellsuspension

· Prinzip:

Lufttrocknung von fixierten Zellen basiert auf der Theorie, dass die Chromosomen in den ersten paar Sekunden nach dem Aufbringen auf den Objektträger durch das Fixativ beim Spreiten unterstützt werden.

Wenn das Fixativ verdunstet, senkt sich der Meniskus der Fixativ-Schicht auf die Oberfläche der Zelle herab und drückt die Chromosomen zwischen die untere und obere Membran. Dies bewirkt eine Spreitung der Chromosomen.
Diese physikalische Erschlaffung bis zum Kollaps der Zellmembran braucht allerdings eine gewisse Zeit. Dies ist der heikle Moment bei der Erstellung von Chromosomenpräparaten.

Index

:: Prinzip
:: feuchte Objektträger
:: das Auftropfen
:: Luftfeuchtigkeit und Temperatur
:: Verdünnung der Zellsuspension
:: Objektträger
:: Kontrolle im Phasenkontrast
:: Quellenangabe

· Tipps:

Trocknet das Fixativ zu schnell, bleibt ein sichtbarer Zytoplasmasaum im Hintergrund zurück. Das bedeutet, dass die Chromosomen dicker werden (dunkler im Phasenkontrast) und nicht gut gespreitet sind, da sie keine Zeit dazu hatten.
Eine Färbung von Chromosomen, die noch immer durch das Zytoplasma "geschützt" werden, ist nur schlecht möglich.

Gut gespreitete Chromosomen haben ebenfalls eine intakte Zytoplasmamembran um sich herum, aber sie ist so dünn, dass sie unsichtbar bleibt und bei der Färbung nicht stört.

Dauert der Trocknungsvorgang zu lange, weicht das Zytoplasma komplett auf, bekommt Löcher und Chromosomen können wegschwimmen.
Trotzdem kann es vorkommen, dass bei langer Trocknungszeit schlecht gespreitete Metaphasen zu finden sind. Grund dafür ist, dass die Zellen in der Flüssigkeitsschicht des Fixativs auf dem Objektträger herumrollen. Dabei hat die Zellmembran keine Möglichkeit zur Erschlaffung, die Chromosomen können sich nicht ausreichend spreiten (Rolleffekt).

Genau dieser Effekt tritt auch bei hoher Luftfeuchtigkeit auf (sichtbarer Zytoplasmasaum, schlechte Spreitung - was in diesem Fall nicht auf zu schnelle Trocknung zurückzuführen ist), sondern auf das Herumrollen der Zellen.

Hohe Luftfeuchtigkeit führt normalerweise zu zerstreuten Chromosomen, niedrige Luftfeuchtigkeit zu kurzen überkreuzten.

Sobald fixierte Zellen auf dem Objektträger getrocknet sind, halten sie so fest, dass durch die nachfolgende Färbung keine Chromosomen mehr verlorengehen können.

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:: Feuchte Objektträger

Feuchtigkeit (Wasser) auf dem Objektträger erleichtert das Spreiten durch das unmittelbare Zurückweichen des Wassermeniskus, sobald das Fixativ auf das Wasser trifft. Die dabei entstehende Energie (Energie der Dehydration) drückt die Metaphase auseinander.
Das zurückweichende Wasser sollte entfernt werden (auf Papiertuch ablaufen lassen), eventuell mit Fixativ abspülen.

Das Spreiten kann durch die Benutzung verschiedener Wassertemperaturen für den Objektträger beeinflusst werden.

· Tipps:

Kalte, feuchte Objektträger trocknen langsamer. Warme Objektträger in Kombination mit warmer Raumtemperatur beschleunigen die Trocknungszeit.

Auch die Dicke des Wasserfilms kann variiert werden:
- mehr Feuchtigkeit an trockenen, warmen Tagen
- weniger Feuchtigkeit an feuchten Tagen (hier kann auch ein Nachspülen mit Fixativ die Trocknungszeit verkürzen)

Fragile Metaphasen (z.B. Zellen bei ALL) vertragen nur wenig Feuchtigkeit - hier reicht der Hauch des Atems völlig aus (Objektträger soll nur "beschlagen" sein).

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:: das Auftropfen

Es gibt mehrere Möglichkeiten, wie der Objektträger während der Präparationstechnik gehalten wird.

Manche zytogenetischen TechnikerInnen halten den Objektträger horizontal, tropfen dabei entweder in Schlangenlinien auf oder punktuell.

Andere wieder erlauben der Zellsuspension, sich über den Objektträger zu bewegen, nachdem sie aufgetropft wurde, indem der Objektträger schräg gehalten wird - entweder entlang der langen Achse (Beschriftungsfeld oben oder unten) oder entlang der kurzen Achse (eine lange Seite unten). Ob das Spreiten dadurch gefördert wird, weil die Zellen sich bewegen können, ist nicht bewiesen.
Objektträger mit einem langen Ende unten tendieren zur Gleichförmigkeit bei der Trocknungszeit, vor allem wenn der Winkel 20-30° beträgt und die Zellen am oberen Drittel des Slides plaziert werden, um nach unten laufen können.
Ein zu großer Winkel bewirkt, dass die Flüssigkeit zu rasch abläuft und der Objektträger vor allem oben zu schnell trocknet.

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:: Luftfeuchtigkeit und Raumtemperatur

Der relative Luftfeuchtigkeitsgehalt ist der Prozentsatz an Feuchtigkeit in der Luft.

Warme Luft enthält mehr Feuchtigkeit als kalte - eine relative Luftfeuchtigkeit von 50% in kalter Luft bedeutet einen geringeren Absolutwert an Feuchtigkeit als in warmer Luft.

Das bedeutet für unsere Objektträgerpräparation, dass Zellen bei unterschiedlichen Temperaturen unterschiedlich spreiten, auch wenn die Luftfeuchtigkeit gleich bleibt.
Wird es wärmer, erhöht sich die Spreitung, weil die Luft feuchter ist und die Trocknungszeit dadurch länger wird.

In trockener Luft verdunstet das Fixativ sehr schnell (rasche Trocknung), während es in feuchter Luft langsam verdunstet (langsame Trocknung).

· Beeinflussung bei zu geringer Luftfeuchtigkeit (Trocknungszeit verlängern):

- den Objektträger vor einem Luftbefeuchter trocknen lassen
- auf ein feuchtes Tuch stellen oder legen (ev. auf Heizplatte legen, damit das Tuch dampft)
- über Wasserdampf auftropfen
- Objektträger kälter und/oder feuchter machen

· Beeinflussung bei zu hoher Luftfeuchtigkeit (Trocknungszeit verkürzen):

- Luftentfeuchter aufstellen
- Objektträger erwärmen
- Luftstrom

Luftbewegung, ähnlich der einer leichten Brise, kann die Trocknungszeit beeinflussen - also beschleunigen. Sofort nach dem Auftropfen und Abtupfen der überschüssigen Flüssigkeit über den Objektträger blasen, in durch die Luft fächeln oder einen Fön benutzen.

· Die "ideale" relative Luftfeuchtigkeit:

Sie hängt von der Umgebungstemperatur, der Genauigkeit des Hygrometers und der Technik des Erntens ab.

Die in situ Erntetechnik benötigt eine 5-10% höhere Luftfeuchtigkeit als jene für Suspensionen. Monolayer-Kulturen stellen sehr viel heiklere Ansprüche an die Feuchtigkeit in Bezug auf die Trocknungszeit als Peripheres Blut oder Knochenmark. Man kann sich damit helfen, dass man die Objektträger nach der Fixierung in eine kleine Kammer mit "idealen" Bedingungen stellt. Die Schräge der aufgestellten Objektträger kann zusätzlich die Trocknungszeit beschleunigen oder verlangsamen (je steiler und je schneller dadurch das Fixativ abfließen kann, umso schneller die Trocknungszeit).

"Ideal" sind laut Erkenntnissen und diversen Studien 20°C Raumtemperatur und eine Luftfeuchtigkeit von 45%. Aber auch 50% Luftfeuchtigkeit bei 25°C werden genannt (bei Problemen mit zerstreuten Chromosomen Luftfeuchte auf 35% senken).

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:: Verdünnung der Zellsuspension

Es sollten beim Auftropfen nicht zuviele Zellen auf ein und denselben Fleck aufgebracht werden - die Chromosomen können sich sonst nicht gut ausbreiten. Außerdem verschlechtert eine dicke Zellschicht die Trocknungszeit.

:: Objektträger

Die verwendeten Objektträger müssen vollständig sauber sein, um eine gleichmäßige Verteilung der Suspension zu gewährleisten.

Dazu die Objektträger für mindestens einen Tag in 95% Alkohol einstellen, damit sämtliche Fettspuren beseitigt werden. Vor dem Auftropfen muss der Alkohol restlos beseitigt werden - dazu die Objektträger wässern und zuletzt in Aqua dest stellen.

Das Beschriftungsfeld mit einem harten Bleistift beschriften, um Partikelauswaschung durch das Fixativ zu vermeiden. Andere Stifte meiden - fast alle lösen sich bei Berührung mit dem Methanol-Essigsäure-Gemisch auf und verunreinigen das Chromosomenpräparat.

Werden Objektträger ohne Beschriftungsfeld verwendet, diese nach dem Trocknen mit einem fuselfreien Papier abdecken und das untere Ende mit einem Diamantschreiber beschriften.

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:: Kontrolle der Chromosomenqualität im Phasenkontrast

Die ungefärbten Chromosomen erscheinen von grau bis schwarz, abhängig von den Trocknungsbedingungen - die Bandenqualität wird davon abhängig sein.

· Beachtet werden soll:

1) Chromosomenverstreuungen (zerbrochene Metaphasen, übergespreitet) - bringt diagnostische Probleme (Mosaikerkennung erschwert)
2) Chromosomenüberlagerung
3) ideal ist ein lediglich dünner Zytoplasmasaum, damit Trypsin-G-Banding optimal werden kann
4) Zelldichte (abhängig von der Verdünnung der Zellsuspension)
5) keine zerrissenen Chromatiden (gesplittete Arme) - kann auch am Colcemid® oder der hypotonen Lösung liegen
6) hellgraue Chromosomen ergeben Trypsin-empfindliche Zellen mit schwachem Bandenkonstrast
7) schwarze Chromosomen zeigen Plasmahintergrund und sind resistent gegen Trypsin

· Problemlösung:

Die Chromosomen sollen sein: scharf und dunkel ohne helle Ränder rundherum

Erscheinen die Chromosomen grau, sind sie blass, ausgefranst oder zerstreut:
- Trocknungszeit verkürzen (zu lange gedauert bis trocken)
- weniger feuchte Bedingungen schaffen
- Objektträger länger wärmen (auf die Hand legen, Heizplatte)

Sind sie allerdings schlecht gespreitet mit hellen Rändern um die Chromosomen, zu dunkel bis schwarz und zeigen Zytoplasma:
- Trocknungszeit verlängern (sie sind zu schnell getrocknet)
- Wärme reduzieren (länger trocknen lassen)
- kälteres Wasser / kältere Objektträger nehmen

Zudem :: Luftfeuchtigkeit und Raumtemperatur :: beachten.

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:: Quellenangabe

· The AGT Cytogenetics Laboratory Manual

Autor: M.J. Barch, T. Knutsen, J.L. Spurbeck
Jahr: 3. Auflage
Verlag: Lippincott-Raven
ISBN 0-397-51651-7