Das Ernten

Sobald die ideale Wachstumsdauer erreicht ist bzw. eine Kontrolle des Wachstums bei Monolayer-Kulturen eine ausreichende Mitosenanzahl ergibt, wird das Wachstum gestoppt.

Der Vorgang des Unterbrechens wird auch "Ernten" genannt (engl.: harvest). Monolayer-Kulturen werden in situ geerntet, von allen anderen Zellkulturen werden Suspensionen angefertigt.


Index

:: Colcemid®
:: Hypotone Lösung
:: Fixativ
:: Quellenangabe

:: Colcemid®

Colcemid® ist ein synthetisches Analog zu Colchizin, welches ein Alkaloid der Herbstzeitlose und weitaus giftiger ist. Colcemid® ist lichtempfindlich und verliert auch im Kühlschrank seine Wirksamkeit, daher das Reagenz-Fläschchen unbedingt in Alufolie einpacken !

· Prinzip:

Chromosomen sind normalerweise nur erkennbar, wenn man sie maximal kontrahiert (weil sie sonst lange dünne Würste wären) – das gelingt nur während der Zellteilung (Kultur).

Colcemid® bewirkt das Absterben der Spindelfasern, wodurch das Auseinanderweichen der Schwester-Chromatiden verhindert wird. Dieser Schritt wird "Stoppen des Wachstums" bzw. "Unterbrechen" genannt.

Wirkt Colcemid® längere Zeit auf das Chromatin ein, tritt ein Kondensationseffekt auf. Der Effekt tritt verstärkt auf bei Peripherem Blut, Knochenmark und Chorionzotten, im Gegensatz zu Amnionzellkulturen und soliden Tumoren. Langsam wachsende Zellen tolerieren längere Einwirkzeiten von Colcemid®.

Beim gemeinsamen Einsatz mit Wirkstoffen wie Ethidiumbromid oder BrdU kann die Konzentration von Colcemid® erhöht werden. Sie mildern den Kondensationseffekt, bewirken eine langsamere Spreitung und verhindern eine Verkürzung der Chromosomen.

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:: Hypotone Lösung

· Prinzip:

Die Salzkonzentration der Kaliumchlorid-Lösung außerhalb der Zellen ist niedriger ("hypoton") als in der Zelle selbst. Die hypotone Lösung erhöht das Zellvolumen nun durch den Effekt der Osmose. Wasser fließt durch die Zellmembran ins Innere der Zelle, um den unterschiedlichen Salzgehalt von Zelle und Umgebung auszugleichen. Ein größeres Zellvolumen bedeutet für die Chromosomen, dass sie mehr Platz haben und sich besser ausbreiten können. Zudem quillt das Chromatin und wird dadurch besser sichtbar gemacht.
Wird die hypotone Lösung erwärmt und die Kultur bei 37°C inkubiert, wird der Effekt erhöht, weil der Wassertransport durch die Zellmembran beschleunigt wird. Zusätzlich wird die Zellmembran aufgeweicht.

Als man die hypotone Behandlung Anfang der 50er Jahre des 20. Jahrhunderts noch nicht kannte und beherrschte, hatte man oft das Problem, dass die Chromosomen zusammenklebten. So war man anfänglich ja auch der Meinung, der Mensch habe 48 Chromosomen. Erst durch eine Verbesserung der hypotonen Behandlung konnten die Chromosomen immer besser voneinander getrennt und dargestellt werden.

Wirkt die hypotone Lösung jedoch zu lange auf die Zellmembran ein, kann diese zu sehr aufweichen und sogar platzen, was den Verlust einzelner Chromosomen zur Folge hat.

Die kernlosen Erythrozyten platzen während der Behandlung komplett und werden dadurch beseitigt. Granulozyten gehen schon während der Kultivierung unter, weil sie die Kultivierungsbedingungen nicht mögen. Lymphozyten sind etwas "haltbarer": die meisten von ihnen schwellen an, platzen aber erst beim Auftropfen.

· Tipps:

Verschiedene Salztypen können die Größe und Länge der Chromatiden beeinflussen. Mit Natriumcitrat werden zumeist längere Chromatiden erreicht als mit Kaliumchlorid (KCl).

Viele Zelltypen reagieren empfindlich auf die hypotone Behandlung, vor allem solide Tumoren und Zellen der ALL (akute lymphatische Leukämie). Überbehandlung kann somit die Zellen völlig zerstören.

Beste Resultate werden erreicht, wenn die hypotone Behandlung so kurz wie möglich gehalten wird. Ideal sind 10-20 Minuten.

Salzkonzentrationen:

für alle Zelltypen geeignet - KCl 0,075 mol/L
für neoplastische Zellen geeignet - 0,4% KCl
für alle Zelltypen geeignet außer Amnionzellen - 0,7% Natriumcitrat
für Amnionzellen - 1,0% Natriumcitrat

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:: Fixativ

· Prinzip:

Die Fixierung ist ein Konservierungsprozess. Sie hat die Aufgabe, die Gewebestruktur zu konservieren und den Verlust von Nukleinsäuren zu verhindern. Durch die Denaturierung wird die Aktivität endogener Nukleasen und anderer gewebsabbauender Enzyme gering gehalten. Zudem wird die Zellmembran elastisch fixiert.

Dabei senkt das Fixativ den ph-Wert der Zelle und denaturiert sie. Anschließend wird die Zelle dehydriert, das Wasser im Zellinneren entfernt und durch Methanol ersetzt, Proteine und DNA verändert.
Die Zellmembran und das Chromatin werden gehärtet und die Chromosomen für die nachfolgende Bänderungsprozedur präpariert. Sind die Zellen erst einmal fixiert, kann man sie wochenlang im Tiefkühlschrank aufheben.

Da eine Formalin-Fixierung keine Bänderung ermöglicht, wird ein Methanol-Essigsäure-Gemisch im Verhältnis 3:1 verwendet. Methanol ist ein Zellhärtungswirkstoff, die Essigsäure hingegen fungiert als Weichmacher.
Je nach Ratio des Gemisches kann die Zellmembran gehärtet oder aufgeweicht und damit die Spreitung der Chromosomen beeinflusst werden.

Das Fixativ verändert die Chromatin-Struktur nur wenig, kaltes (-20°C) Fixativ schützt die Chromosomenmorphologie. Zusätzlich hat das Gemisch einen lysierenden Effekt auf Erythrozyten und Debris. Das aus den Erythrozyten freigesetzte Hämoglobin denaturiert, zu erkennen am Farbumschlag von rot nach braun.

Werden die Zellen über Nacht in fixiertem Zustand im Kühlschrank aufbewahrt, härtet die Zellmembran noch mehr, wodurch empfindliche Zellen dem Auftropfen auf einen Objektträger besser standhalten.

· Tipps:

Beim Austausch von hypotoner Lösung gegen das Fixativ entstehen Turbulenzen, die ein Zerbrechen der Metaphasezellen bewirken können. Daher sollte das Fixativ vorerst sanft zugesetzt werden. Sobald die Zellen gehärtet sind, kann der Fixativ-Wechsel rascher erfolgen.

Das verwendete Fixativ sollte immer frisch hergestellt werden.
- Mit der Zeit bilden sich im Gemisch als Reaktion zwischen den beiden Reagenzien Acetate, die den ph-Wert senken.
- Weiters sind sowohl Methanol als auch Essigsäure hygroskopisch, d.h. sie absorbieren Feuchtigkeit aus der Luft. "Verwässertes" Fixativ verschlechtert die Spreitung der Chromosomen als auch deren Qualität.
- Das Fixativ kann zudem durch feuchte Reagenzgefäße kontaminiert werden, aber auch durch hohe Luftfeuchtigkeit.

Kunststoffgefäße, in denen das Fixativ gemischt wird bzw. in denen die Suspensionen erstellt werden, sollten "Fixativ-tauglich" sein - am besten ist Polypropylen (PP, matter Kunststoff) geeignet.

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:: Quellenangabe

· The AGT Cytogenetics Laboratory Manual

Autor: M.J. Barch, T. Knutsen, J.L. Spurbeck
Jahr: 3. Auflage
Verlag: Lippincott-Raven
ISBN 0-397-51651-7