Kultivierung

Vorsterilisierte Einwegmaterialen und käufliche Reagenzien werden bereits in vielen Labors verwendet.

Es ist wichtig, die Materialien mit einem Datum zu versehen und sie an geeigneten Orten aufzubewahren - kurz gesagt: die Manufaktur-Hinweise bezüglich Ablaufdatum und Lagerungsbedingungen zu beachten.

Aus Kostengründen wenden aber viele Labors eine Reihe von "Do-it-yourself"-Methoden an - dabei ist es wichtig, die Hintergründe zu Sterilisation, Wasser für Zellkulturen, Temperatur, ph-Wert und Luftfeuchtigkeit, Medien, PBS (balanced salt solution), Trypsinieren und Antibiotika zu verstehen.


Index

:: Kulturgefäße
:: Hitzesterilisation
:: Sterilfiltration
:: Umgebungsbedingungen
:: Wasser
:: Anheftungsfaktoren
:: Medien
:: PBS-Puffer
:: Antimikrobielle Reagenzien
:: Quellenangabe

:: Kulturgefäße

Sterile Einwegkulturgefäße aus Kunststoff umfassen Flasks, Gewebskulturschalen (Petrischalen), Zellkulturröhrchen, Schrägtuben sowie spezielle Gefäße wie Chamber Slides und Slide Flasks.

Für wiederverwendbare Kulturgefäße aus Glas sind spezielle Wasch- und Sterilisationprozeduren notwendig, was zwar billiger, als weitaus aufwendiger ist als Einweggefäße zu benutzen.

Die in situ Chromosomenanalyse erfordert, dass die Zellen auf einer Oberfläche wachsen, welche direkt für die Analyse verwendet werden kann. Dazu werden Deckgläser in Petrischalen kultiviert. Flasks und Kulturröhrchen werden für ein Backup benutzt, für den Fall dass die in situ Kultur nicht anwachsen sollte.

Für in situ Kulturen können aber auch spezielle Gefäße (Slide Flasks, Chamber Slides) benutzt werden, in denen der Monolayer direkt auf dem Objektträger wächst. Das Gefäß selbst, das wie ein Häuschen auf dem Slide sitzt, kann vor dem Ernten einfach abgenommen werden.

Flasks, egal welcher Art, haben seitlich einen Schraubverschluss - wird er nur leicht aufgeschraubt, werden die Zellen im offenen System kultiviert, fest zugeschraubt ergibt sich ein geschlossenes System. Schraubkappen mit eingebautem Filter dienen ebenfalls dem Gasaustausch mit der Umgebung.

Für Suspensionen werden Röhrchen verwendet - entweder Rundbodenröhrchen oder Schrägtuben. Die Röhrchen werden schräg bzw. flach in einem speziellen Ständer inkubiert, durch das lose bzw. feste Aufschrauben des Deckels kann man wie bei den Flasks ein offenes oder geschlossenes System erreichen.

:: TOP ::

:: Hitzesterilisation

Heißluftsterilisation

165°C für 2 Stunden

· Pasteurpipetten
· Instrumente im Metallbehälter
· gläserne Kulturgefäße (mit Alufolie abdeckt)

Auch Deckgläser für die in situ Kultur können Heißluftsterilisiert werden - 100°C für 1 Stunde

Autoklavieren

fast exhaust: 121°C für 20-30 Minuten, 15psi

· Kulturgefäße aus Glas mit heißluftempfindlichen Deckeln (halboffen im Autoklav, danach zuschrauben)
· Instrumente in Tüchern
· Materialen aus Gummi- oder Kunststoff
· Zellschaber

slow exhaust: 121°C für 30 Minuten, 15psi

· Gefäße mit Flüssigkeiten (maximal 2/3 voll, Deckel halb offen)
· wiederverwendbare Membranfilter

Offene Flamme

Die übliche Praxis, die Öffnungen steriler Kulturgefäße und die Ränder von Reagenzflaschen immer wieder abzuflammen, ist abzulehnen. Gegen einen gelegentlichen Einsatz dieser Methode ist nichts einzuwenden, vor allem dann wenn sterile Lösungen aus ihrem Behältnis ausgegossen werden.

:: TOP ::

:: Filtrieren von Flüssigkeiten

Verwendet werden hierzu Sterilfilter mit einer Porengröße von 0,20 bis 0,22 ug.

Die Filtrationsrate ist zwar geringer als mit einer Porengröße von 0,45 ug, jedoch können kleine gram-negative Bakterien von größeren Filtern nicht zurückgehalten werden.

Zwischenfilter werden benötigt, wenn partikelhaltige Flüssigkeiten oder Serum filtriert wird.

Filtriert wird mittels einer Vakuumpumpe. Dabei ist darauf zu achten, dass keine Luft angesaugt wird, da Luft die Poren des Sterilfilters verstopft.

:: TOP ::

:: Umgebungsbedingungen

Zellkulturen von Säugetierzellen benötigen eine konstante Temperatur von 37-37,5°C, einen pH-Wert von 7,2-7,4 und eine Luftfeuchtigkeit nahe des Sättigungsbereichs, üblicherweise 96-98%.

Temperatur

Eine konstante Temperatur erreicht man mit einem luftzirkulierten oder wasserummantelten Brutschrank, sofern die Türen nur selten geöffnet werden.

pH-Wert

Der pH-Wert für menschliche diploide Zellen wird durch eine konstante CO2-Atmosphäre und einem Bikarbonat-Puffer im Kulturmedium erreicht. Organische Puffer, wie z.B. HEPES, kommen auch ohne die CO2-Atmosphäre aus.

HEPES ist ein organisches Molekül mit starker Pufferkapazität und einem pKa von 7,3, welches selbst bei verschiedensten Temperaturen relativ konstant bleibt. Der einzige Nachteil bei der Verwendung von HEPES ist, dass es in zu hoher Konzentration (mehr als 20mM) toxisch wirkt. Deshalb wird HEPES üblicherweise in Kombination mit Earle's Puffer verwendet.

Etwas Phenolrot im Medium bietet sich als einfacher, sensibler Indikator für den pH-Wert an. Der ideale Wert liegt vor, wenn das Medium eine Farbe zwischen rosa und rehbraun aufweist. Gelb ist zu sauer, pink zu alkalisch.

Brutschrank / offenes System

Wichtig ist ein feuchter, begaster Brutschrank für die Zellkultivierung. Er ist aber auch eine Quelle für Kontamination der Kulturen. Häufige Reinigung/Dekontamination ist wichtig. Dazu sollten jedoch spezielle Desinfektionsmittel verwendet werden, da Rückstände in der Wärme verdampfen und in die Kulturen gelangen.

Gegen Mycoplasmen gibt es spezielle Mittel, die entweder in den Wassermantel des Brutschranks gemischt oder mittels Sprühflasche direkt im Brutschrankinneren aufgetragen werden.

Brutschrank / geschlossenes System

Alternativ dazu gibt es die Möglichkeit, Zellkulturflaschen mit der notwendigen CO2-Konzentration von 5% zu begasen und die Deckel fest zu verschließen. Diese Methode ist ebenfalls für eine kleinere Anzahl von Petrischalen geeignet, die dazu tendieren auszutrocknen oder Temperatur und pH zu wechseln.

Das geschlossene System verhindert, dass die Bedingungen sich ändern, sobald der Brutschrank geöffnet wird bzw. ausfällt. Es ist allerdings ungeeignet, wenn man sehr viele Zellkulturen ansetzt.

:: TOP ::

:: Wasser

Wenn man seine Reagenzien bzw. Medien selbst herstellt, müssen für die Basis - nämlich Wasser - bestimmte Regeln eingehalten werden, sonst wachsen die Zellen nicht.

Ungeeignet

· deionisiertes Wasser
· einfach-destilliertes Wasser
· destilliertes Wasser, das nicht in einem Glasdestillator hergestellt wurde
· Leitungswasser

Geeignet

Gutes Wasser für Zellkulturen ist in Glas- oder Quartzdestillatoren dreifach-destilliertes Wasser. Der pH-Wert sollte bei Verwendung beinahe neutral sein (auf keinen Fall sauer).

In Krankenhäusern wird Aqua destillata zumeist selbst hergestellt, ist pyrogen-frei und in vivo für intravenösen Gebrauch gedacht. Dass Wasser für Zellkulturen steril sein muss, ist wohl selbstverständlich.

:: TOP ::

:: Adhäsions- / Anheftungsfaktoren

Wachstum und Differenzierung von Zellen in vitro werden wesentlich von dem verwendeten Substrat (Glas, Kunststoff) beeinflusst. Beschichtet ("coaten") man die Oberflächen der Kulturgefäße mit Adhäsionsfaktoren wird häufig ein besseres Zellwachstum erreicht.

Adhäsionsfaktoren scheinen für eine Vielzahl von Zell-Basalmembran-lnteraktionen verantwortlich zu sein, wie z.B. für Adhäsion, Migration aber auch Proliferation. Sie fördern die Anheftung von vielen epithelialen Zelltypen an Typ IV Kollagen. Dies gilt sowohl für normale als auch für Tumorzellen und alle anderen Zellen, die eine Basalmembran besitzen. Darüber hinaus wird durch Adhäsionsfaktoren die Neigung vieler Zellen zur Entdifferenzierung verhindert.

typische Anheftungsfaktoren

· Collagen
· Polylysin
· Fibronektin
· Laminin
· Gelatin

Fibronektin
Fibronektine sind große Zelloberflächen-Plasmaproteine, die strukturelle und adhäsive Bestandteile von zell-assoziierten fibrillären Matrices sind. Fibronektin ist eines der primären Zelladhäsionsmoleküle.

Laminin
Laminine sind große heteromerische Glykoproteine, die eine kreuzförmige Struktur einnehmen. Die Moleküle bestehen aus drei verwandten, aber unterschiedlichen Ketten, die durch Disulfidbrücken verknüpft sind und ein großes, kreuzförmiges Molekül bilden. Laminine werden vor allem aus Gewebe mit einem hohen Anteil an Basalmembranen isoliert.

:: TOP ::

:: Zellkulturmedien

Käufliche Medien sind steril in flüssiger oder lyophilisierter Form erhältlich. Selbstgemachte Medien werden nach standardisierten Rezepten hergestellt. Es ist wichtig, die richtige Art von Wasser zu verwenden (siehe oben), wenn das Medien selbstgemacht oder ein käufliches Pulver aufgelöst wird.

Für das Wachstum von Säugetierzellen benötigt man 15%iges fetales Kälberserum (Bandbreite von 5-30%, abhängig vom Kulturmedium und den Zellen, die damit wachsen sollen). Unterschiedliche Lot-Nummern des Herstellers bedeuten zumeist unterschiedliches Zellwachstum. Deshalb sollte man Kälberserum vor dem Erstgebrauch austesten, vor allem in der Pränataldiagnostik, wo das Probenmaterial zumeist unwiederbringlich ist.

Kälberserum sollte vom Hersteller auf Mycoplasmen getestet sein, weil das Serum als Kontaminationsquelle für diese Mikroorganismen gilt. Die dafür nötige Hitzeinaktivierung von 30 Minuten bei 56°C beeinflusst das Zellwachstum nachteilig und soll unbedingt vermieden werden.

Fetales Kälberserum muss eingefroren verschickt werden. Danach wird es einmalig aufgetaut und aliquotiert wieder eingefroren. Immer erst vor Gebrauch dem Medium zugeben.

Komplettmedien (inklusive allen instabilen "last minute" Zusätzen wie Kälberserum, Glutamin und Antibiotikum) sollten nicht länger als 7 Tage (maximal 10) im Kühlschrank lagern.

:: TOP ::

Zusammensetzung von Kulturmedien

Alle Kulturmedien bestehen aus vier Basisbestandteilen: Aminosäuren, Kohlenhydrate, anorganische Salze und Vitamine.

Aminosäuren
Aminosäuren (essentielle und nicht essentielle) werden für die Proteinsynthese benötigt.
· Essentielle Aminosäuren können von den Zellen nicht selbst produziert werden und müssen daher von außen zugeführt werden.
· Nicht essentielle Aminosäuren hängen vom Stoffwechsel der individuellen Zellen ab, können von den Zellen selbst erzeugt werden und müssen daher nicht unbedingt über das Medium zugeführt werden. Eine Rezeptur, welche nicht essentielle Amniosäuren enthält, kann jedoch die stoffwechselbedingte Energieverbrennung der Zellen reduzieren. Das wiederum erlaubt den Zellen schneller zu wachsen.

Kohlenhydrate
Zucker ist das häufigste Kohlenhydrat in Säugetierzellen. Er stellt die größte Energiequelle für die Biosynthese dar. Durch die Glykolyse wird Zucker gespalten und durch den Stoffwechsel verbraucht.

Anorganische Salze (Balanced Salts)
Anorganische Salze sind essentiell für das Zellwachstum. Sie liegen als große Ionen in Form von Natrium, Magnesium, Kalium, Kalzium, Phospaten, Chloriden, Sulfaten und Bikarbonat vor.
Anorganische Salze helfen außerdem dabei die Zellularmembran zu erhalten, indem sie den osmotischen Druck regulieren. Fügt man dem Medium anorganische Salze zu, wirken sie als eine Art Puffersystem, das die Zellen vor ph-Wert-Schwankungen und stoffwechselbedingten Abfallprodukten zu schützen.

Vitamine
Vitamine sind generell in allen Medienrezepturen vorhanden und wirken als Katalysator - sie fördern bzw. zu steuern bestimmte metabolische Funktionen. Die meisten Zellen benötigen Vitamin B.
Andere Vitamine oder Coenzyme, die nur von manchen Zellen benötigt werden, sind nur in speziellen Zellmedien vorhanden.

Andere Komponenten
Viele Zellkulturmedien enthalten einen ph-Wert-Indikator (zumeist Phenolrot), damit ph-Wert-Schwankungen visuell erkennbar sind.
Andere organische und anorganische Komponenten werden den Medien zugefügt, um das Zellwachstum zu beeinflussen.

:: TOP ::

übliche Zellkulturmedien

Eagle's Basismedium (BME)
Eagle's Basismedium wurde ursprünglich als minimale Rezeptur entwickelt, um das Wachstum von HeLa-Zellen zu fördern.
Das BME Medium wird mit einem Serumsupplement in 5-10% CO2-Atmosphäre verwendet und kann für ein breites Spektrum normaler und veränderter Zelllinien verwendet werden.

Minimum Essential Medium (MEM) oder Eagle's MEM
MEM/EBSS wurde von Harry Eagle als Modifikation zu seinem BME Medium entwickelt.
MEM ist ein nicht komplexes Medium, das für eine breite Palette von Säugetierzellen verwendet werden kann, sofern es mit einem Serumsupplement kombiniert wird.
MEM mit EBSS ist für die Verwendung in 5% CO2-Atmosphäre gedacht. Für geschlossene Systeme sollte MEM mit HBSS verwendet werden.
· kann für jede Art von Zellkultur verwendet werden

MEM-Alpha Modifikation
Alpha Modifikation enthält nicht essentielle Aminosäuren und war ursprünglich für Nierenzellen vom Hamster gedacht, wurde aber auch für die erfolgreiche Anzüchtung von Embryozellen verwendet.
Alpha MEM unterstützt die Ausreifung tierischer Oozyten, genau wie bei der Embryonenentwicklung zu Morula/Blastozyten- und Blastozyten-Stadium.

Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium
DMEM Low und High Glucose Medium enthält eine vierfach höhere Konzentration an Aminosäuren und Vitaminen als BME, und weiters nicht essentielle Aminosäuren.
DMEM Medium wurde ursprünglich für die Kultivierung von nicht veränderten Maus- bzw. Hühnerzellen entwickelt. Das Medium ist für den Gebrauch mit einem Serumsupplement bei 10% CO2-Atmosphäre gedacht.
· DMEM und seine Modifikationen werden weitgehend für ein breites Spektum von Säugetierzellen verwendet.

Medium 199
Medium 199 ist eines der ersten chemisch definierten Medien und wird ohne Serumsupplement für das fortlaufende Wachstum von primären Hühnerembryoherzzellen und Fibroblasten verwendet.
Medium 199 mit Earle's ist optimiert für eine 5-10% CO2-Atmosphäre.
· eignet sich gut für Lymphozytenkulturen

:: TOP ::

HAM'S F-10 und F-12
Ham's F-10 wurde ursprünglich für serumfreies Zellwachstum von chinesischen Hamster Ovarzellen, HeLa-Zellen und Mouse1-Zellen entwickelt.
Versetzt mit Serum oder in Kombination mit Hormonen und Wachstumsfaktoren können diese Medien für ein breites Spektrum von Säugetier- und Hybridomzellen verwendet werden. Für optimales Puffersystem sollte 5% CO2-Atmosphäre verwendet werden.
· speziell für klonales Wachstum von Säugetierzellen
· am besten für Langzeitkulturen geeignet (Amniocentese, Chorionzotten, Fibroblastenkultur)

Mc COY's 5A
Mc COY'S 5A Medium wurde ursprünglich als eine Modifikation des Basalmediums 5A entwickelt.
Mc COY'S 5A versetzt mit einem Serumsupplement und in 5% CO2-Atmosphäre kann für ein breites Spektrum von Primärkulturen verschiedenster Gewebetypen verwendet werden.
· für jede Art von Zellkultur geeignet, gutes Transportmedium
· dennoch bevorzugt für Knochenmark verwendet

RPMI 1640
RPMI 1640 Medium wurde von Moore und seinen Mitarbeitern 1966 entwickelt. Ursprünglich war es für das Zellwachstum von menschlichen Leukämiezellen in Monolayerkulturen oder Suspensionen gedacht.
Seither wird es mit Zugabe eines Serumsupplements universell für das Zellwachstum eines breiten Spektrums von Säugetierzellen und Hybridzellen eingesetzt.
· für Suspensions-Kulturen (Peripheres Blut, Knochenmark, solide Tumoren)
· der geringer Thymidine-Gehalt macht es zum geeigneten Medium für Methotrexate-, FdU- und Thymidine Block Synchronisations-Kulturen
· ohne Zusätze ein ideales Transportmedium

Chang Medium®
Chang Medium® ist ein Fertigmedium und wird üblicherweise für Primärkulturen von Aminozyten und das Zellwachstum von Chorionzottenbiopsien verwendet, kann aber auch für die Kulturen von Knochenmarkzellen verwendet werden.
Das Medium wurde sowohl für den Gebrauch in 5% CO2-Atmosphäre als auch für das geschlossene System entwickelt.
· speziell für Amniozyten und Chorionzotten

AminoGrow plus
AmnioGrow Medium ist ein Fertigmedium und wird für das Zellwachstum von Amionzellen und Chorionzotten verwendet.
AmnioGrow plus enthält FKS (fötales Kälberserum), Wachstumsfaktoren, Insulin, L-Glutamin und Gentamycin.
· für Amniozyten und Chorionzotten

Liebovitz L-15
L-15 wurde ursprünglich für den CO2-freien Gebrauch entwickelt. Es ist lediglich mit anorganischen Salzen, freien Aminosäuren und Galactose (statt Glucose) gepuffert. Supplimentiert ist L-15 am besten für das Wachstum von Hepatozyten geeignet, aber auch für Embryonalgewebe und Fibroblastenkulturen.
· entwickelt für das Wachstum von Fibroblasten im Beisein von Serum, aber ohne CO2

:: TOP ::

:: Balanced Salt Solution

· PBS-Puffer (phosphate buffered saline)
· Earle's Solution
· Hanks's Solution

Der pH-Wert sollte 7,2 - 7,4 betragen.

wird benötigt für:

· zum Spülen von blutigen und schmutzigen Kulturen
· zum Spülen vor dem Erstellen von Subkulturen (Entfernen von Serum-haltigen Medium, da Kälberserum eine trypsinhemmende Wirkung hat)
· als Puffer in bestimmten Medien

Trypsinieren

PBS enthält wenig Calcium und Magnesium, was bei der Lösung von Zellen sehr hilfreich ist (als Verdünnungsmittel für Trypsin). Weiters hindert es frische Zellen daran, zu verklumpen.

Für das Erstellen von Subkultuen wird üblicherweise 0,05 - 0,25 % Trypsin verwendet, um Zellen aus Monolayer-Kulturen enzymatisch vom Untergrund zu lösen und in Suspension zu bringen. Die Stärke und Einwirkdauer dieses Enzyms sind kritische Faktoren für ein gutes Wachstum nach der Trypsinierung.

Um die hemmenden Substanzen des Kulturmediums zu entfernen, wird vor dem Trypsinieren die Kultur zweimal mit PBS-Puffer gespült. Die Aktivität des Enzyms wird nach Erreichen der Einwirkzeit durch Zugabe von serumhaltigem Medium stoppt.

Manche menschlichen diploiden Zellen sind schwerer zu lösen, vor allem wenn Monolayer-Kulturen zu dicht wachsen und die Zellen sich überlagern. Auch AF-Zellen am Ende ihres Wachstumspotentials und epitheliale Zellen kugeln sich nur schlecht ab.

Helfen kann hier eine mechanische Methode, um Zellen nach der enzymatischen Behandlung vom Untergrund zu lösen:
· Schütteln oder Aufklopfen des Kulturgefäßes
· Benutzen eines Zellschabers

:: TOP ::

:: Antimikrobielle Reagentien

Antibiotika werden in Transportmedien verwendet, aber auch für Primärkulturen, um Kontamination zu bekämpfen. Für die Routine-Kultur ist die Zugabe von Antibiotika zum Medium optional.

Wird das Medium selbst hergestellt, soll das Antibiotikum erst zugegeben werden, nachdem das Medium sterilfiltriert wurde.

Zellkulturmedien sind die ideale Umgebung für das Wachstum von Bakterien und Pilzen. Der beste Weg, um eine Kontamination des Medium zu erkennen, ist den pH-Wert zu beobachten - es verändert sich die Farbe des Mediums (normalerweise in den sauren Bereich, also gelb).

Durch Wachstumskontrolle im Inversen Mikroskop kann folgendes auf eine bakterielle Kontamination hinweisen:

· schlechtes Zellwachstum
· Zellen mit verschwommenen Rändern
· steigende Anzahl von losgelösten Zellen
· Verlust einen ganzen Zelllayers

Pilzwachstum kann man mikroskopisch anhand der Pilzsporen problemlos erkennen. Suspekte Kulturen müssen isoliert oder mit 10% H2O2 dekontaminiert und verworfen werden.

Antibiotika

· Penicillin-Streptomycin - Penicillin 50-100 U/ml, Streptomycin 50-100 ug/ml
· Kanamycin (10-100 ug/ml), Gentamycin (50 ug/ml) und Polymyxin B Sulfat (100 U/ml) sind Breitbandantibiotika, die zugegeben werden können, wenn die Kontamination resistent auf Penistrepto ist

Antimykotika

· Nystatin (50-100 ug/ml) und Amphotericin B
· Fungizone (2,5 ug/ml)

:: TOP ::

:: Quellenangabe

· The AGT Cytogenetics Laboratory Manual

Autor: M.J. Barch, T. Knutsen, J.L. Spurbeck
Jahr: 3. Auflage
Verlag: Lippincott-Raven
ISBN 0-397-51651-7