Probenmaterial und Ansatz

:: Probenmaterial ::

Für eine erfolgreiche Kultivierung ist die richtige Abnahme mindestens so wichtig wie die Wachstumsbedingungen selbst.

Dazu gehört neben den sterilen Abnahmebedingungen vor allem das Übersenden des Probenmaterials in richtigen Abnahmeröhrchen bzw. Transportmedium.

Index

:: Amniocentese
:: Peripheres Blut
:: Knochenmark
:: Gewebe
:: Chorionzotten
:: Abortmaterial
:: Quellenangabe

:: Amniocentese

Bei der Amniocentese wird eine Punktionsnadel unter ständiger Ultraschallkontrolle in die Amnionhöhle vorgeschoben und Fruchtwasser mit einer Spritze abgesaugt.
Um mütterliche Kontamination weitgehend zu vermeiden, werden die ersten Milliliter Fruchtwasser verworfen. Der Rest (idealerweise 20 ml pro Patientin) wird nativ in der Spritze ans humangenetische Labor übersandt.

Wird die Amnionzellkultur erst am nächsten Tag angelegt, das Fruchtwasser unbedingt bei Raumtemperatur lagern.

Ansatz

Amnionzellflüssigkeit wird bei 1000 U/min zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet in Kultur gebracht. Zuvor wird Material für die AFP-Bestimmung, den FISH-Schnelltest und eine mögliche PCR abgezweigt.

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:: Peripheres Blut

Das Abnahmeröhrchen für Peripheres Blut enthält einen NH-Sodium-Heparin-Zusatz (Vacuette® mit grünem Stoppel).

In unserem Labor wurde die Erfahrung gemacht, dass EDTA-Zusatz (Vacuette® mit violettem Stoppel) bei Vollblutansatz das Zellwachstum behindert - insbesondere bei Nabelschnurblut und kindlichem Peripherem Blut.

Aus diesem Grund muss EDTA vor dem Vollblutansatz ausgewaschen werden. Dazu das Blut bei 1000 U/min zentrifugieren, den Überstand dekantieren, das Pellet mit sterilem 0,9% NaCl auffüllen und das Blut erneut zentrifugieren. Diesen Vorgang noch zweimal wiederholen.
Das Blut mit Heparin versetzen, um ein nachträgliches Gerinnen zu verhindern. Eventuell auch das Medium mit Heparin versetzen.
(Tipp von Fr. Helga Grüner, Hanuschkrankenhaus)

Wird die Lymphozytenkultur erst am nächsten Tag angelegt, das Blut unbedingt bei Raumtemperatur lagern. Laut den Erfahrungswerten in unserem Labor bleiben die Lymphozyten mindestens 5 Tage vital.

Ansatz

· Vollblutansatz - 0,4 bis 1,0 ml Blut werden in 5 bis 10 ml Medium eingebracht

Bei Neugeborenen und bei Patienten mit einem hohen Hämatokrit sollte eine geringere Blutmenge in Kultur gebracht werden, da zuviele Erythrozyten pro Milliliter Blut die Kultur beeinträchtigen können.

pro 10 ml Kulturmedium:

· 0,8 ml Vollblut bei Erwachsenen
· 0,6 ml Vollblut bei Neugeborenen und Kindern
· 1 ml Vollblut bei schwangeren Frauen

· Ansatz des buffy-coats

Zur Auftrennung der Blutbestandteile wird das Periphere Blut bei 800 rpm für 5-10 min zentrifugiert. Der buffy-coat befindet sich zwischen den roten Zellen am Röhrchenboden und dem Plasma als hellgrauer/weißlicher Ring.

Um die Auftrennung zu erleichtern, können die mononukleären Zellen (Lymphozyten und Monozyten) mit Trennlösungen wie Ficoll®, Percoll oder Lymphoprep isoliert werden. Dazu wird 1:1 mit NaCl verdünntes Vollblut über die Trennlösung geschichtet und zentrifugiert. Die mononukleären Zellen bilden danach eine weiße Grenzschicht zwischen Plasma und Ficoll®-Lösung, die Erythrozyten und Granulozyten befinden sich im Sediment.

Der buffy coat wird nach der Zentrifugation vorsichtig mit einer Pasteurpipette abgehoben, mit NaCl verdünnt und 2 bis 3 mal gewaschen. Vom gewaschenen Pellet werden 0,5 bis 1,0 ml in 10 ml Kulturmedium eingebracht.

Für eine optimale Lymphozytenkultur sollten 1 bis 2 mal 10hoch6 Leukozyten pro Milliliter Medium angesetzt werden.

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:: Knochenmark

Knochenmark wird üblicherweise direkt in der Abnahmespritze übersandt, die vor der Entnahme mit Heparin versetzt wird.

Eine weitere Möglichkeit ist, Knochenmark in heparinisiertes RPMI 1640 aufzunehmen (Fläschchen). Daraus werden die verschiedenen Spritzen für Immunologie, Zytogenetik etc. entnommen. So entgeht man der Gefahr, dass bei neuerlicher Aspiration an derselben Puntionsstelle nur mehr Blut in einer "Portion" ist und somit jeder aus demselben Material befundet.
(Tipp von Fr. Helga Grüner, Hanuschkrankenhaus)

Ansatz

Bei Knochenmarkaspiraten ist es üblich, die Zellzahl zu bestimmen. Bei lymphozytenreichen Aspiraten ist ein Vollblutansatz möglich, zellarme Aspirate werden mittels Ficoll® getrennt und nur die mononukleären Zellen in Kultur gebracht.

Fr. Grüner vom Hanuschkrankenhaus hat festgestellt, dass bei Auftrennung aller "blutiger" Proben mittels Ficoll® die Qualität der Metaphasen deutlich gesteigert werden kann.

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:: Gewebe

Untersuchbares Material:
Lymphknoten-PE, Tonsillen, Biopsien aus infiltriertem Gewebe (z.B. Zungengrund), Milzgewebe, Ascites und Pleuraflüssigkeiten bei Patienten mit malignen Lymphomen.

Die gewonnenen Proben sollten nativ sofort von den operierenden Stellen in einem sterilen Gefäß an die Pathologie gesandt werden und dort ebenso rasch ein Stück in ein Transportmedium für die Zytogenetik überführt werden.

Als Transportmedium eignet sich RPMI 1640. Gewebe sollte so rasch wie möglich verarbeitet und in Kultur gebracht werden, da es mazeriert und seine Vitalität verliert. Fibroblastenkulturen wachsen nur dann gut, wenn sie 100% vital sind.
Wenn die Gewebeproben nicht nekrotisch sind, was manchmal selbst bei ganz frischem Material der Fall sein kann, gelingt bei gut 90% der Proben auch ein aussagekräftiger Befund.

Ansatz

Alle festen Gewebestücke werden mit einigen Milliliter Kulturmedium durch ein feinmaschiges Sieb gedrückt, die Zellzahl bestimmt und anschließend mit einer Dichte von 2x10hoch6/ml in Kultur gebracht.

Bei Milzgewebe, sofern es nicht massive sichtbare Infiltrate aufweist und man die Infiltrate aus der roten Pulpa ausschneiden kann, wird die Hälfte der Zellsuspension über Ficoll 1,077 isoliert, um die Erythrozyten zu eliminieren.

Aszites und Pleuraflüssigkeit wird, wenn sehr blutig, ebenfalls mittels Ficoll® getrennt. Ansonsten nur abzentrifugieren, 1x mit steriler 0,9% NaCl waschen und das Pellet in Kultur bringen.

Zellen von Körperflüssigkeiten können wie Fibroblastenkulturen angelegt werden. Sie bilden mesodermale (mesenchymale) Zellen aus.

:: Ich danke an dieser Stelle Fr. Helga Grüner vom Genetischen Labor des Hanuschkrankenhauses für diese sehr interessanten Informationen bezüglich Gewebekulturen.

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:: Chorionzotten

Bei der Chorionzottenbiopsie wird Gewebe mit darin enthaltenen kindlichen Zellen entnommen. Wichtig ist es, zwischen mütterlichen und kindlichen Zotten zu unterscheiden. Werden irrtümlich mütterliche Zotten entnommen, führt dies zu einem falschen Ergebnis der zytogenetischen Untersuchung

Die Chorionzottenbiospie wird in einem Transportmedium, üblicherweise RPMI-1640 versetzt mit Heparin, übersandt.

Ansatz

Chorionzotten werden im Labor in zwei Petrischalen mit Kulturmedium übergeführt und über Nacht bei 37°C im CO2-Brutschrank inkubiert. Am nächsten Tag wird zum einen Teil eine Direktpräparation angeschlossen, die restlichen Zotten werden in Langzeitkultur gebracht.

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:: Abortmaterial

Gewebe wächst als Fibroblastenkultur am besten, wenn es 100% vital ist. Das ist ein Grund, warum Abortmaterial als Fibroblastenkultur eine so hohe Ausfallsquote (bis zu 60% kein Wachstum) aufweist. Abortmaterial ist oftmals mazeriert, da die Frucht zumeist schon längere Zeit abgestorben ist.

Im Idealfall kann der Humangenetiker das Gewebe selbst bzw. mit Hilfe des Pathologen entnehmen - und zwar Unterhautbindegewebe des Fetus. Es reichen schon minimale Mengen für ausreichendes Wachstum, da beim Fetus noch kaum Unterhautgewebe ausgebildet ist.
Muskelgewebe eignet sich für eine Fibroblastenkultur nicht.
Als Transportmedium wird RPMI-1640 verwendet.

Besser eignen sich jedoch die Chorionzotten der Plazenta. Chorionzotten bleiben selbst nach Absterben der Frucht über Stunden vital, daher ist mit einer Wachstumsrate weit über 90% zu rechnen. Entnimmt man sie in Nabelschnurnähe ist garantiert, dass man kindliche Zotten anzüchtet. Als Transportmedium verwendet man auch hier RPMI-1640, versetzt mit einem Antibiotikum.

Ansatz

Die Chorionzotten werden im Labor in eine Petrischale mit Kulturmedium übergeführt und über Nacht bei 37°C im CO2-Brutschrank inkubiert. Am nächsten Tag werden sie in Langzeitkultur gebracht.

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:: Quellenangabe

· The AGT Cytogenetics Laboratory Manual

Autor: M.J. Barch, T. Knutsen, J.L. Spurbeck
Jahr: 3. Auflage
Verlag: Lippincott-Raven
ISBN 0-397-51651-7