Historische Entwicklung der Zytogenetik

Uhren

Mit der Verbesserung von Mikroskopen wurden Chromosomen zum ersten Mal in der Mitte des 19. Jahrhunderts beobachtet. Zum Ende des Jahrhunderts versuchte man bereits die Anzahl der menschlichen Chromosomen herauszufinden. Es hat aber ca. ein halbes Jahrhundert gedauert, bis 1956 die korrekte Anzahl der Chromosomen beim Menschen identifiziert wurde.

:: Der Beginn ::

Lange Zeit fiel die Sichtbarmachung und Auszählung eines kompletten Chromosomensatzes und die Identifikation einzelner Chromosomen äußerst schwer, da es schwierig war geeignete Präparationen von Metaphasen herzustellen, in denen die Chromosomen in ihrer kondensierten und spiralisierten Form vorlagen und beobachtet werden konnten.

So spekulierte man seit 1920 über die Chromosomenzahl des Menschen, die über lange Jahre zwischen 8 und 50 vermutet wurde. In den 1930er Jahren gelang es mit der Einführung des Colchicins in die Aufbereitung von Zellen, diese bei der Zellteilung in der Metaphase zu arretieren (Blakeslee & Avery, 1937;Levan, 1938). Der wahre Durchbruch kam 1952 mit der Beschreibung des Effekts von hypotonen Lösungen auf Chromosomen in drei unabhängigen Veröffentlichungen (Hughes, 1952; Hsu,1952; Makino & Nishimura, 1952). Dieser Effekt bestand in einer besseren Ausbreitung der Chromosomen auf dem Objektträger. 

Index

:: Der Beginn
:: erste Bänderungstechniken
:: In Situ Hybridisierung
:: FISH
:: Interphase-Zytogenetik
:: CGH
:: Multicolour FISH
:: MLPA
:: mBAND
:: DNA-Mikroarray
:: Array-CGH
:: SNP-Arrays
:: Quellenangabe

1956 war es dann erstmals möglich, die exakte Anzahl der Chromosomen mit 46 anzugeben (Tijo & Levan, 1956; Ford & Hamerton, 1956). Diese Entdeckung war Anstoß für den Beginn der klinischen Genetik.

Drei Jahre später wurde die Trisomie 21 als Ursache für das Down-Syndrom erkannt, gefolgt von 45,X beim Turner-Syndrom und 47,XXY im Klinefelter-Syndrom. Diese Entdeckungen wurden anhand der Knochenmark-Analyse gemacht. 1960 wurde diese Technik jedoch von der Leukozyten-Methode, der Lymphozytenkultur, verdrängt. Im selben Jahr wurde das erste Mal eine chromosomale Aberration in der Form des Philadelphia-Chromosoms, als Ursache für eine Krebs-Erkrankung entdeckt (Ferguson-Smith MA., 2008).

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:: Klassische chromosomale Färbe- und Bänderungstechniken

KaryogrammTrotz dieser Fortschritte war es oft unmöglich aus Metaphasechromosomen ein genaues Karyogramm zu erstellen, so dass oft nur die Zuteilung in eine der sieben Chromosomengruppen (A-G) gelang. Es wurden Chromosomen betrachtet, die eine einheitliche Färbung aufwiesen. Auf diese Weise konnten die Chromosomen nicht eindeutig voneinander unterschieden werden und man konnte nur Aneuploiden, Markerchromosomen und sehr große Veränderungen entdecken (Feuk L. et al., 2006).

Erstmals gelang es Ende der 1960er Jahre in Stockholm Lore Zech mit der Substanz Quinacrin distinkte fluoreszierende Banden entlang menschlicher Chromosomen zu erzeugen (Caspersson et al., 1968,1969,1970). Im Jahr 1969 wurde die Methode entwickelt, Chromosomen nach einer Behandlung mit einem proteolytischen Enzym mit Giemsa (GTG-Bänderung, GAG-Bänderung) zu färben. Dies ergab für jedes Chromosom ein spezifisches Bandenmuster, welches eine eindeutige Identifikation des Chromosoms erlaubte (Ferguson-Smith MA., 2008) und die den heutigen Standard in der klassischen Chromosomenfärbung darstellt.

Allen Färbemethoden ist gemein, dass sie für jedes Chromosom spezifische und reproduzierbare Banden ergeben, die eine eindeutige Identifikation der Chromosomen, die sogenannte Karyotypisierung, zulassen. Die hellen Banden sind GC- und somit Gen-reiche Abschnitte. Dort befinden sich sogenannte „Haushaltsgene“, die häufig abgelesen werden und deswegen früh replizieren, sowie schwächer gefaltet sind, als die DNA in dunklen Banden.  Normale Metaphasenpräparationen zeigen durchschnittlich eine Auflösung von 450 Banden.

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:: In Situ Hybridisierung (ISH)

In situ Hybridisierung ist eine zytochemische Methode, die eine sensitive Erkennung und Lokalisation spezifischer Nukleinsäuresequenzen im Chromosom ermöglicht. Sie wurde im gleichen Jahr wie die ersten Bänderungstechniken (1969) entwickelt und basiert auf der Möglichkeit, dass sich an der gesuchten Sequenz der DNA (Zielsequenz) ein synthetisierter komplementärer Strang (Sonde) anlagern kann (Übersicht in van der Ploeg, 2000).

Diese Sonde muss mit einem sogenannten Reportermolekül markiert sein, damit die Zielsequenz später sichtbar gemacht werden kann. Anfangs gelang diese Markierung mit radioaktiven Substanzen.
Dabei waren die experimentellen Prozeduren relativ riskant, langsam und ergaben zwar sensitive aber nur gering auflösende Ergebnisse.

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:: Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)

FISHIn den letzten 20 Jahren erhöhte sich die Sensitivität der Fluoreszenz in situ Hybridisierung auf das 10.000fache des ursprünglich Möglichen. Mit Einführung der FISH konnte allgemein das
Interesse für in situ Hybridisierungen deutlich erhöht werden. Es kam zu einer rapiden
Entwicklung in diesem Bereich, die zu den heute möglichen äußerst sensitiven, spezifischen und
hoch auflösenden FISH-Ergebnissen führte.

Ein wichtiger Schritt in dieser Entwicklung war die enzymatische Synthese von Biotin-markierten
Nukleinsäuren in einer Form, die es ermöglichte, dass die markierten Nukleinsäuren weiterhin in
DNA und/oder RNA eingebaut werden konnten (Langer et al., 1981). In den späten 70ern konnten DNA-Fragmente in Bakterien kloniert werden und ein gewünschter Teil des Genoms konnte aus einer Bibliothek herausgesucht und in ausreichender Menge amplifiziert werden (Ferguson-Smith MA., 2008). Solche BAC-Bibliotheken werden auch heute noch verwendet.

Der erste konkrete Einsatz fluoreszenzmarkierter Sonden erfolgte 1982 und bot gegenüber radioaktiv markierten Sonden den Vorteil der sichereren und einfacheren Anwendung (van Prooijen-Knegt et al., 1982). Außerdem erhoffte man sich, mit einem Hybridisierungsansatz mehrere Zielsequenzen innerhalb eines Chromosomensatzes mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen gleichzeitig detektieren zu können.

1985 konnte mit Hilfe der FISH das erste menschliche Gen, das des Thyreoglobulins, einer chromosomalen Bande zugeordnet werden (Landegent et al., 1985). Diesen Prozess, einem Gen den genauen Ort (Locus) innerhalb des Chromosomensatzes zusortieren zu können, bezeichnete man als gene mapping, welches in den folgenden Jahren exzessiv weiter betrieben wurde. Dazu wurden bekannte Sequenzen bestimmter Gene synthetisiert, fluoreszenzmarkiert und auf menschliche Chromosomen hybridisiert, um anschließend sehen zu können, in welcher Bande auf welchem Chromosom das entsprechende Gen liegt.

Zu dieser Zeit wurden viele solcher geklonten Bereiche des menschlichen Genoms hergestellt, die man einem exakten Locus auf einem Chromosom zuordnen wollte. Je nach Größe und Art des Wirtes wurden solche Sequenzen, die zur weiteren Klonierung in Plasmide verpackt wurden, als Cosmide, BACS, PACS oder YACS bezeichnet. Umgekehrt konnten diese entwickelten Sequenzen nun von Zytogenetikern genutzt werden, um abnorme Chromosomen mit FISH besser charakterisieren und beteiligte Gene identifizieren zu können.

Metaphase-FISHDamit wurde die Entdeckung der Mikrodeletionen, die per Definition lichtmikroskopisch auf GTG-gebänderten Karyogrammen nicht erkannt werden können, eingeleitet. Diese Methode wird auch verwendet, um z.B. Bruchpunkte von strukturellen Veränderungen genauer einzuengen, als es mit der GTG-Bänderung möglich ist. Es lassen sich Deletionen, nicht tandemartige Duplikationen, Inversionen und Translokationen bestimmen (Murken J. et al., 2006, Nussbaum RL. et al., 2007).

Heute wird die FISH-Methode auch zur Validierung von Array-generierten Daten verwendet. Dafür muss die Veränderung aber eine entsprechende Größe haben (Feuk L. et al., 2006). Nach Denaturierung werden diese Sonden auf fixierte und ebenfalls denaturierte Metaphasenchromosomen hybridisiert. Die Auflösung dieser Methode ist abhängig von der Sondengröße. Nach mikroskopischer Evaluation können Mikrodeletionen ab 10 kb detektiert werden, es ist aber auch eine Sondengröße von 1 kb erreicht worden (Trask BJ., 2002).

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:: Interphase-Zytogenetik

Interphase-FISHEine weitere Entwicklung in der FISH war die Hybridisierung der Sonden auf Interphase-Zellkernen (Cremer et al., 1986). Der Begriff der Interphase-Zytogenetik wurde erstmals 1986 geprägt und besaß großes Potenzial für biologische und klinische Anwendungen, vor allem in Bereichen, in denen nur kleine Zahlen der aberranten Zellen im Verhältnis zur Gesamtzellzahl vorhanden waren. Dies galt besonders für Tumorzellen, die häufig numerische und/oder strukturelle Aberrationen zeigten.

Zudem wurde durch diese Methode die elementarste Einschränkung der klassischen Zytogenetik, die Erfordernis von sich teilenden Zellen umgangen, um die korrekte Anzahl der Kopien eines Chromosoms nicht nur in Metaphasen, sondern auch in Interphase-Zellkernen zu erfassen. Dabei wurde in der Auswertung die Anzahl der Signale (Spots) für die jeweils verwendete chromosom-spezifische Sonde im Kern ausgezählt. Abweichungen in der Spotzahl konnten auf Verluste oder Zugewinn genetischen Materials hinweisen.

Weiters bestand ein Vorteil dieser Methode darin, dass der Kondensationsgrad in Interphasen geringer war als in Metaphasen und somit eine größere Auflösung bei der FISH an Interphase-Zellkernen möglich war. Dies bedeutete, dass Sonden, die bei Hybridisierung auf Metaphasechromosomen einen Mindestabstand von 1 Mb haben müssen, um noch getrennt visualisiert werden zu können, bei Hybridisierung auf Interphasenuclei nur 50 kb voneinander getrennt sein mussten, um als einzelne Signale erkannt werden zu können (Trask et al., 1989; Lawrende et al., 1990; van den Engh et al., 1992).

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:: Comparative genomische Hybridisierung (CGH)

CGHMit der Technik der comparativen genomischen Hybridisierung erhielt man die Möglichkeit, komplette Genome, ohne vorherige Kenntnisse möglicher involvierter Chromosomen oder chromosomaler Regionen, auf genetische Veränderungen hin zu untersuchen (Voorter et al., 1995).

Im Gegensatz zur herkömmlichen Fluoreszenz in situ Hybridisierung wurde bei der CGH die komplette DNA des zu untersuchenden Gewebes als DNA-Sonde eingesetzt. Dies bot den Vorteil, dass für eine genetische Untersuchung kein vitales Zellmaterial, aus dem ansonsten Metaphasechromosomen gewonnen werden müssten, notwendig war.

Zum Nachweis genetischer Imbalancen wurde die zu testende DNA mit DNA normaler männlicher Zellen, der sogenannten Referenz-DNA, verglichen. Hierzu wurden Referenz- und Test-DNA mit unterschiedlichen Fluoreszenz-Farbstoffen markiert und im Verhältnis 1:1 gemischt. Diese DNA-Mischung wurde als Sonde für eine in situ Hybridisierung an Metaphasechromosomen gesunder männlicher Spender eingesetzt. Das Vorgehen wurde als „reverse in situ Hybridisierung“ bezeichnet, da bei diesem Verfahren nicht direkt die Chromosomen des zu untersuchenden Materials als Struktur analysiert wurden.

Bei der Anlagerung der DNA-Mischung an die korrespondierenden DNA-Abschnitte der Metaphasechromosomen kompetitierten die Anteile aus der Test- und Referenz-DNA um Bindung. Lagen alle Chromosomenabschnitte der Test- und Referenz-DNA im gleichen Verhältnis vor, so kam es zu einer homogenen Mischanfärbung der Chromosomen. Waren jedoch in der Test-DNA im Vergleich zur Referenz-DNA einzelne Chromosomenabschnitte überrepräsentiert, so färbte sich der betreffende Abschnitt des Metaphasechromosoms vermehrt in der Farbe der Test-DNA an.

Fehlten in der Test-DNA Segmente, so überwog an der betreffenden Stelle die Färbung der Referenz-DNA. Die Fluoreszenzverteilung und -intensität auf den hybridisierten Metaphasechromosomen wurde mittels eines Bildanalysesystems für jedes Fluorochrom separat erfasst und in einem Fluoreszenzratioprofil verrechnet. Die Ausprägung der Fluoreszenzunterschiede hing dabei von der Größe des veränderten Chromosomenabschnitts sowie dem Anteil der veränderten Zellen in der Probe ab, aus der die Test-DNA gewonnen wurde. 

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:: Multicolour FISH

M-FISHNachdem Ende der späten 1980er Jahre potente FISH Protokolle entwickelt wurden, die es erlaubten einzelne Loci, kleine Bereiche oder komplette Chromosomen zu färben, arbeitete man an weiteren Entwicklungen, die es ermöglichen sollten, innerhalb einer Metaphase verschiedene Zielsequenzen in verschiedenen Farben zu markieren. Dieses Ziel wurde allgemein als Multicolour FISH bezeichnet.

Das Vorhaben scheiterte eine Zeit lang an der mangelnden Verfügbarkeit geeigneter Fluorochrome. Eine Hybridisierung, die gleichzeitig drei Zielsequenzen in einer Hybridisierung detektierte, gelang 1989 erstmals der Arbeitsgruppe um Nederlof, die als Fluorochrome FITC, TRITC und AMCA verwendeten (Nederlof et al., 1989). Später wurde die Sonde einer Zielsequenz mit einer Kombination aus Fluorochromen markiert, so dass sich für n Fluorochrome 2n-1 Möglichkeiten zur parallelen Markierung einzelner Bereiche ergaben. Somit war es 1996 erstmals möglich alle 24 Chromosomen (22 + X + Y) in unterschiedlichen Farben erscheinen zu lassen.

Um jedes Fluorochrom ausreichend genau detektieren zu können, wurde für jedes einzelne ein eigener Filter mit einer Bandbreite von nur 5-15 nm benutzt. Die Filter wurden so gewählt, dass sich ihre Emissions-Spektren nicht überschnitten. Die DNA-Sonden jedes einzelnen der 24 Chromosomen wurden über Mikrodissektion und DOP-PCR generiert und für jedes Chromosom spezifisch mit einem Fluorochrom oder einer Fluorochromkombination markiert. Nach der Hybridisierung mit dem Mix aus 24 Sonden wurde die Auswertung an einem Fluoreszenzmikroskop mit geeigneten Filtern durchgeführt.

Dabei konnte betrachtet werden, welches Chromosom mit welchem bzw. welchen Fluoreszenzfarbstoffen markiert war. Die für die Auswertung erstellte Software erlaubte es, jedem Chromosom mit seiner spezifischen Kombination aus Fluorophoren eine individuelle Falschfarbe zuzuordnen. So erschien jedes Chromosom in einer eigenen Farbe.

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:: Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)

MLPAIm Jahr 1988 wurde die Polymerase chain reaction (PCR) eingeführt (Saiki RA et al., 1988). Ohne diese enzymvermittelte Amplifikation spezifischer DNA-Fragmente wären solche Techniken, wie die MLPA, Mikro-Arrays oder Next generation sequencing (NGS), nicht möglich.

Bei der Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA), handelt es sich um eine PCR-basierte Methode, wobei im Multiplex-Verfahren Sonden für mehrere Genorte eingesetzt werden.  Beide MLPA-Primer bestehen je aus einer spezifischen Hybridisierungssequenz und einem Universalprimer. Die spezifischen Sequenzen liegen so, dass das 3„-Ende der einen Sonde an das 5„-Ende der anderen anlagert und diese ligiert werden.

Die Ligation kann nicht stattfinden, wenn an dieser Stelle eine Deletion vorliegt, oder sich genau an der Ligationsstelle ein SNP (single nucleotide polymorphism) befindet und daher die letzte Base nicht paaren kann. Dann findet anschließend auch keine PCR statt und das entsprechende Fragment wird nicht amplifiziert. Am Ende der Reaktion erhält man Fragmente unterschiedlicher Längen, die mit Hilfe eines Kapillar-Elektrophorese-Gerätes detektiert werden können (Schouten P. et al., 2002).

Mit dieser Methode können Deletionen ab einer Größe von 1 bp und auch SNPs detektiert werden. Diese Methode wird ebenfalls zur Validierung von Array-Daten verwendet. Da dabei aber keine Einzelsonden, sondern mehrere Sonden im Multiplex benutzt werden können, wird zwecks Validierung oft die quantitative PCR (qPCR) verwendet (Feuk L. et al., 2006). Diese Methode basiert auf der Verdoppelung der DNA-Menge bei jedem Amplifikationsschritt in der frühen Phase der PCR-Reaktion. Die Amplifikation der DNA kann durch den Einbau einer fluoreszierenden Substanz verfolgt werden, was in einem graphischen Plot dargestellt werden kann. Durch den Vergleich dieses Graphen mit dem eines bekannten DNA-Lokus mit bekannter Kopienzahl, kann auf die ursprüngliche DNA-Kopienzahl in der zu untersuchenden Probe rückgeschlossen werden (Murken J. et al., 2006).

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:: High Resolution Multicolour Banding (mBAND)

mBandDie Methode des mBAND wurde erstmals 1999 beschrieben und sollte die vorhandenen Limitierungen der Multicolour FISH Methoden im Bereich intrachromosomaler Aberrationen und genauerer Bruchpunktbestimmung ergänzen (Chudoba et al., 1999). mBAND erlaubte die Unterscheidung regionen-spezifischer Bereiche eines Chromosoms auf dem Level der konventionellen chromosomalen Banden. Die Technik basierte auf dem Gebrauch unterschiedlich markierter, überlappender Mikrodissektionsbibliotheken, sogenannter regionspecific partial chromosome paints (RPCPs). Die wechselnden Fluoreszenzintensitäten entlang eines Chromosoms wurden benutzt, um verschiedene Falschfarben für spezifische chromosomale Bereiche zu generieren. Eine mBAND-Sonde ist immer spezifisch für ein Chromosom.

Zuerst mussten bei der Herstellung einer mBAND-Sonde die RPCPs mit Hilfe der Mikrodissektion erstellt werden (Lüdecke et al., 1989; Senger et al., 1990). Bei der Mikrodissektion handelte es sich um eine Methode, die es unter mikroskopischer Sicht erlaubte, mit einer feinen Glasnadel Chromosomen an beliebigen Stellen zu schneiden und die geschnittenen Stücke separat zu sammeln. Je nach Größe des Chromosoms erhielt man zwischen drei und acht Mikrodissektionsbibliotheken pro Chromosom, die so gewählt waren, dass sie sich zu einem gewissen Grad überlappten. Die Bereiche wurden von mehreren unterschiedlichen Metaphasen geschnitten, wobei gleiche Segmente in einem gemeinsamen Tube gesammelt werden. Bei dieser Prozedur wurde allerdings absichtlich ungenau geschnitten, um leicht unterschiedliche Endbereiche der gewünschten Regionen zu erhalten. Zur anschließenden Markierung der PCR-Produkte standen fünf Fluorochrome zur Verfügung, mit denen jede Region spezifisch markiert wurde.

Nach der Hybridisierung erfolgte die Auswertung geeigneter Metaphasen mit einem Fluoreszenzmikroskop, das einen spezifische Filter enthaltenden Filterrevolver besaß, und einer geeigneten Software.

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:: DNA-Mikroarray

MikroarrayDNA-Mikroarrays entstanden aus der Notwendigkeit heraus, Kopienzahl-Veränderungen genomweit, mit einer möglichst kleinen DNA-Ausgangsmenge und kostengünstig nachweisen zu müssen.  Diese Technologie ging aus der CGH hervor, bei der die relative Menge der entsprechenden DNA-Abschnitte  anhand der Grün/Rot-Ratio ermittelt wird. Eine Weiterentwicklung dieser Technologie führte dann zu den eigentlichen Mikroarrays.

Dabei werden P1 artificial chromosome (PAC)-DNAs (Solinas-Toldo S. et al., 1997), Bacterial artificial chromosome (BAC)-DNAs (Pinkel D. et al., 1998), cDNAs (Pollack JR. et al., 1999), PCR-Produkte (Mantripragada KK. et al., 2004) oder schließlich Oligonukleotide (Brennan C. et al., 2004) auf eine feste Matrize, meist Glasobjektträger gespottet.

Mit der Einführung der Array-Technologie entdeckte man viele Copy Number Variations (CNVs), die definiert sind durch eine Größe von mehr als 1 kb und in phänotypisch normalen Individuen in unterschiedlicher Kopienanzahl vorkommen. Sie können bis zu mehreren Mb umfassen (Edelmann L. & Hirschhorn K., 2009). Im Durchschnitt sind 12 % des Genoms eines Individuums variabel (Rauch A., 2008).

Die Technologien, mit deren Hilfe Sonden auf die Chipoberfläche gebracht werden, haben sich mit der Zeit ebenfalls weiterentwickelt. Im Moment werden u. a. zwei Arten von Technologien verwendet. Die erste sieht die Synthese von Sonden direkt auf der Oberfläche des Chips mittels der Photolithographie und der sogenannten Ink-jet deposition vor (Gresham D. et al., 2008).

Mit der zweiten Technologie werden vorgefertigte Oligonucleotide mittels Druckertechnologien auf Glas-Objektträger gespottet (Shalon D. et al., 1996).

Wie jede andere Technologie haben auch die DNA-Mikroarrays ihre Einschränkungen. Es können zwar kleine Duplikationen und Deletionen festgestellt werden. Bruchpunkte von Translokationen und Inversionen können aber nur erkannt werden, wenn es dort zu Verlust oder Zugewinn von DNA kommt.

Heute sind mehrere Mikroarray-Systeme kommerziell verfügbar. Dabei handelt es sich u. a. um BAC-CGH-Array-, Oligo-CGH-Array- und SNP-Array-Systeme.

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:: Array-CGH

Array-CGHDas Prinzip der Array-CGH kommt der ursprünglichen Methode der CGH auf Metaphasenchromosomen am nächsten. Dabei werden Oligonukleotide verwendet, die auf eine Matrix platziert werden und als Sonden fungieren. Zur Synthese werden die Nukleotide als Monomere mit Hilfe von Druckerköpfen auf Glasplatten gespottet (Hughes TR. et al., 2001). Auf diese Weise entstehen Oligonukleotide mit einer Länge von 60 bp. Eine limitierte Anzahl von Oligonukleotiden ist jeweils drei Mal auf den Chip gespottet und dient zu Kontrollzwecken.

Referenz- und Test-DNA werden dann mit unterschiedlichen fluoreszierenden Farbstoffen markiert und in der gleichen Menge auf die Sonden hybridisiert. Die Array-CGH wird deshalb auch als Zwei-Farben Experiment bezeichnet. Als Referenz- und Test-DNA können dabei Tumor- gegen Normal-Gewebe oder die DNA eines normalen gegen die DNA eines kranken Individuums eingesetzt werden (Gresham D. et al., 2008).

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:: SNP-Arrays

Als Single Nucleotide Polymorphism (SNP´s) werden Variationen einzelner Basenpaare in einem DNA-Strang bezeichnet. Die Definition, dass SNPs bei mindestens 1 % der jeweiligen Population vorkommen müssen, ist nach der Einführung neuester molekulargenetischer Methoden in der Praxis nicht mehr relevant.

SNPs stellen ca. 90 % aller genetischen Varianten im menschlichen Genom dar; sie treten nicht gleichverteilt auf, sondern nur ungleichmäßig stark an bestimmten Regionen. Zwei Drittel aller SNPs bestehen aus dem Austausch von Cytosin durch Thymin.

SNPs werden im Allgemeinen als "erfolgreiche" Punktmutationen bezeichnet, d. h. als genetische Veränderungen, die sich zu einem gewissen Grad im Genpool einer Population durchgesetzt haben. Einige SNPs korrelieren z. B. mit bestimmten Reaktionen des Organismus bei bestimmten Infektionen oder Kontakt mit speziellen Substanzen.

SNP-Arrays

SNP-ArraySNP-Array-Systeme unterscheiden sich von den oben genannten Array-CGH-Systemen in wenigen Punkten. Der wichtigste Unterschied besteht darin, dass nur die Test-DNA mit einem Farbstoff markiert und hybridisiert wird. SNP-Array-Experimente werden deshalb auch als Ein-Farben Experimente bezeichnet. Nach der Hybridisierung wird ein absoluter Wert der Intensität ermittelt und der Vergleich mit der Referenz-DNA erfolgt in silico. Dabei gewinnt man nicht nur Informationen über die Kopienzahl, sondern gleichzeitig auch Genotyp-Daten  (Gresham D. et al., 2008).

Da SNP-Arrays auch Genotyp-Daten anzeigen, können damit der elterliche Ursprung einer de novo Deletion und auch UPDs erkannt werden (Stankiewicz P. & Lupski JR., 2010). Diese sind sichtbar in Form von langen Strecken mit ausschließlich homozygoten SNPs, die als Loss of heterozygosity (LOH)-Regionen bezeichnet werden. Um die UPD aber als solche zu erkennen, müssen die Daten des Indexpatienten mit den elterlichen Genotypdaten verglichen werden (Dufke A. et al., 2008). 

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Limitierungen

Die Unterschiede zwischen den jeweiligen Technologien bezüglich der Abdeckung des Genoms in spezifischen Bereichen, der Qualität der Ergebnisse und der Auswahl der angebotenen Chips sind groß. Die Wahl einer Plattform und der verwendeten Chips sollte in Abhängigkeit von den Fragestellungen und Anforderungen des geplanten Experiments getroffen werden. (Curtis C. et al., 2009). Dazu zählt z.B. die grundlegende Frage, ob nur „Copy Number“-Informationen, oder auch Genotypdaten generiert werden sollen.

Die Array-Methoden sind relativ neu. Es gibt in kurzen zeitlichen Abständen neue Produkte auf dem Markt, für die noch keine Studien bezüglich der Verlässlichkeit der angezeigten Aberrationen existieren. Aus diesem Grund wird generell empfohlen, die generierten Daten mit einer unabhängigen Methode zu validieren (Rauch A. et al., 2008). Die Entwicklung geht in Richtung von immer dichteren Arrays. Die Grenzen dieser Entwicklung sind erreicht, wenn die Sonden so eng benachbart liegen, dass ein Abschnitt der Test-DNA gleichzeitig an zwei Stellen binden könnte (Curtis C. et al., 2009).

:: Quellenangabe

:: Multicolour Banding zur Abklärung intrachromosomaler Aberrationen ::

:: Identifizierung und Charakterisierung von krankheitsassoziierten Mikrodeletionen mit modernen molekularzytogenetischen Methoden ::