MLPA

:: Die Methode ::

Die Abkürzung MLPA steht für Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification. Mit ihr lassen sich schon anhand kleinster DNA-Mengen größere Dosisunterschiede an einem zuvor definierten Ort im Genom nachweisen. Dazu zählen Deletionen/Duplikationen einzelner Genabschnitte (Exons), bzw. ganzer Gene. Dieses gendiagnostische Verfahren erlaubt daher ein Screening auf heterozygot vorliegende Punktmutationen sowie Deletionen oder Amplifikationen in krankheitsspezifischen Genen (z.B. Muskeldystrophie, Mammakarzinom, Leukämie, Syndromdiagnostik).

Dabei wird ein Sondenpaar (»MLPA-Probes«) an die Template-DNA hybridisiert. Ihre Sequenzen sind so gewählt, dass sie direkt nebeneinander zu liegen kommen und daher von einer thermostabilen Ligase verknüpft werden können. In einem zweiten Schritt werden die ligierten Sondenpaare dann per PCR amplifiziert. Ist die Zielsequenz mutiert, können sich die Sondenpaare nicht zusammenlagern und es entsteht kein PCR-Produkt.

Die Amplifikationsprodukte werden durch Kapillarelektrophorese der Größe nach getrennt. Dosisunterschiede sind durch Reduktion oder Vergrößerung der Peakhöhen oder Peakflächen erkennbar. In nur einem Ansatz lassen sich auf diese Weise in einer relativen, quantitativen Darstellung bis zu 45 Gene gleichzeitig screenen. Ein quantitativer Vergleich mit einem Kontroll-Template zeigt heterozygote Mutationen an.

Index

:: Die Methode
:: Das Prinzip
:: Einsatzgebiete
:: MLPA-Schnelltest
:: Quellenangabe


Begriffe

Amplifikation

molekulargenetisches Verfahren zur Vervielfältigung von Nukleinsäuren jeder Art (DNA oder RNA)

PCR

Die Polymerase Chain Reaction ist eine Methode, um die Erbsubstanz DNA in vitro zu vervielfältigen. Dazu wird ein Enzym verwendet, die DNA-Polymerase.

:: Das Prinzip

Kurz zusammengefasst besteht die MLPA aus folgenden Schritten: 

1. Denaturierung
2. Hybridisierung
3. Ligation
4. Amplifizierung

Das Ansetzen einer MLPA ist wesentlich sensibler als eine PCR. So braucht man beispielsweise speziell bearbeitetes Wasser, es genügt nicht, wenn es nur destilliert ist. Ausgewertet wird das Ergebnis am Computer, hierbei wird die Probe der Patientin bzw. des Patienten mit einer gesunden Probe verglichen. So sind sehr schnell mögliche Abweichungen festzustellen und eine Diagnose zu stellen.

MLPA Protokoll

1. Denaturierung der genomischen DNA
    20-500 ng DNA bei 98oC im Thermocycler
2. Zugabe der 2-teiligen MLPA Sonden
    A: komplementär zu Zielsequenz (20-30 Nukleotide)
    B: komplementär zu Zielsequenz (25-43 Nukleotide)
    Zugabe von Sonden-Mix (bis zu 40 verschiedenen Sonden)
    + Stuffer Sequenz (19-370 Nukleotide)
    + Universal Primer-Sequenzen
    Hybridisierung über Nacht (ca. 16 Std.) bei 60oC
3. Zugabe der Ligase samt Ligasebuffer
    Ligation der beiden Sondenhälftenligate bei 54oC für 15 Minuten
4. Inaktivierung der Ligase durch Erhitzen bei 98oC.
    Hinzufügen von Universal-Primern, dNTPs und Polymerase
    Starten der Multiplex-PCR
5. Fragmentanalyse mittels Kapillar-Elektrophorese

 Vor- und Nachteile

Southern Blot
In den Anfängen der DMD-Diagnostik sehr wichtig, wird heute nicht mehr verwendet.

Multiplex-PCR
Nach wie vor valable Methode
Rasch, effizient, gute Detektionsrate

Nachteil: keine Duplikations- und Carrieranalysen

Quantitative Real-time PCR
Vor allem für den Nachweis bzw. die Bestätigung bekannter heterozygoter Deletionen und Duplikationen geeignet

MLPA
Für alle drei Fragestellungen geeignet
Analyse der gesamten codierenden Region wie bei Southern Blot
Rasch, 100% Detektionsrate
Vereint die Vorteile aller übrigen Methoden in sich

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:: Einsatzgebiete

Chromosomale Defekte sind eine der häufigsten Ursachen für Fehlbildungs- und Retardierungssyndrome.
Aufgrund des beschränkten Auflösungsvermögens der konventionellen Zytogenetik wurden in
den letzten zwei Jahrzehnten eine Vielzahl von molekularzytogenetischen und molekulargenetischen
Verfahren entwickelt, welche einerseits die Identifikation von Chromosomenmaterial unbekannter
Herkunft erlauben als auch den Nachweis von submikroskopischen Defekten ermöglichen.

Dafür stehen verschiedene Formen der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH), wie Painting sowie
Gen- und Locusspezifische Sonden zum Nachweis von Mikrodeletions- und Mikroduplikationssyndromen
und auch kryptischen Subtelomerrearrangements zur Verfügung. Die relativ neue, alternative
und kostengünstige Screeningmethode für solche, mit konventioneller Zytogenetik nicht nachweisbaren
submikroskopischen Veränderungen, ist die MLPA.

In einer einfachen und eleganten Weise erlaubt diese Technik unter anderem ein effizienteres Subtelomerscreening als mit FISH, die gleichzeit ige Erfassung von mehr als 20 bekannten Mikrodeletions- und Mikroduplikationssyndromen, sowie den Nachweis von best immten Mutationen in 14 von derzeit
19 bekannten Genen, welche mit nicht syndromaler, X-gebundener (und daher überwiegend bei
Knaben auftretenden) mentaler Retardierungsformen assoziiert sein können.

Das optimale Auflösungsvermögen zur Analyse von quantitativen Umst rukturierungen des Genoms wird zur Zeit allerdings nur mehr mit diversen Mikroarraymethoden erreicht, welche, nach der konventionellen Zytogenetik, die erste Wahl bei der diagnostischen Abklärung darstellt und in den nächsten Jahren wahrscheinlich einen Großteil der anderen Techniken ersetzen und verdrängen wird.

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:: MLPA-Schnelltest

Beim kostengünstigeren, molekulargenetischen MLPA-Schnelltest wird nach DNA-Extraktion durch ein semiquantitatives Verfahren auf die Anzahl der vorhandenen Allele geschlossen.

Prinzipiell funktioniert der Test ähnlich wie FISH über die Hybridisierung der Sonden an die zu testende DNA. Anstatt aber die Gendosis in einzelnen Zellkernen auszuzählen, wird bei MLPA die Menge vorhandener spezfischer DNA-Abschnitte ins Verhältnis gesetzt zur entsprechenden Menge bei gesunden Testpersonen.

Die Auswertung erfolgt nicht am Fluoreszenzmikroskop, sondern anhand der Signalfläche des Ergebnisausdrucks eines Kapillarsequenziergerätes. Durch Vergleich des Gendosismusters des Embryos mit dem gesunder Kontrollpersonen können Abweichungen erkannt werden.

Bei einem ca. 1,5fach erhöhten Signal besteht Verdacht auf eine Trisomie, d. h. es gibt drei statt normalerweise zwei homologe Chromosomen. Anhand der Signale für X und Y kann das Geschlecht bestimmt werden. Dabei erkennt man am Gesamtprofil bereits optisch, ob eine Abweichung vorliegt. Zusätzliche Sicherheit wird durch eine mathematische Flächenauswertung erreicht.

Nicht nachzuweisen sind mit dieser Methode im Gegensatz zu FISH seltene Mosaikzustände und Triploidie. Kontamination des Fruchtwassers durch mütterliches Blut kann das Ergebnis verfälschen, daher sollte an blutigen Proben kein MLPA-Schnelltest vorgenommen werden.

Weil die MLPA-Technik erst vor wenigen Jahren entwickelt wurde, liegen im Vergleich zum FISH-Schnelltest deutlich weniger Daten bezüglich der diagnostischen Sicherheit vor. Eine Studie an etwa 500 Proben (Referenz: Slater H R et al (2003) 40:907-912 “Rapid, high-throughput prenatal detection of aneuploidy using a novel quantitativ method (MLPA)”) bescheinigt dem Test aber eine ähnlich hohe Sicherheit. Selbstverständlich sollten nur anhand des MLPA-Ergebnisses keine weitergehenden Entscheidungen getroffen werden. Genau wie bei FISH muss auf alle Fälle das Ergebnis der Langzeitkultur abgewartet werden. 

:: Quellenangabe

· Labordiagnostische Möglichkeiten und Algorithmen zur Abklärung von potentiell chromosomal verursachten Syndromen

Vortrag am 4. Zytogenetik Forum Österreich, 12. April 2008 

Univ.Prof.Dr. Haas Oskar A.
medgen.at GmbH
Jurekgasse 5
1150 Wien 

Internetquellen:

:: MLPA-Website ::
:: MLPA-Schnelltest ::