Array-CGH

:: Defintion ::

Die Array-CGH ist eine molekulargenetische Untersuchungsmethode, mit welcher das gesamte Genom auf das Vorliegen von Veränderungen untersucht werden kann. Verglichen mit der Chromosomenanalyse wird bei der Array-CGH eine ca. 100-fach bessere Auflösung erzielt.

Gegen ein Raster von immobilisierten DNA-Fragmenten (Matrix oder DNA-Chip) wird eine vergleichende genomische Hybridisierung durchgeführt und das Verhältnis der Fluoreszenzsignale der Patienten- und Referenz-DNA bestimmt.

Einsatzgebiete

Schon lange sind komplexe Syndrome bekannt, die auf Vermehrung oder Verminderung des chromosomalen Materials beruhen. So ist bei der Trisomie 21 ein komplettes Chromosom dreifach statt doppelt vorhanden. Bei Mikrodeletionssyndromen wie z. B. dem Williams-Beuren-, Prader-Willi- oder Smith-Magenis Syndrom fehlen mehr oder weniger definierte Abschnitte eines Chromosoms in meist submikroskopischer Größenordnung von einigen Megabasen. Bei den monogenetischen Erkrankungen entdeckt man in jüngster Zeit immer häufiger Deletionen oder Duplikationen einzelner Gene oder Genabschnitte als krankheitsverursachend.    

Alle Techniken, die bisher in der Diagnostik von genetischen Veränderungen eingesetzt werden, haben ihre Beschränkungen: So kann bei molekularzytogenetischen Methoden wie FISH oder molekulargenetischen Methoden wie MLPA zwar mit hoher bzw. höchster Auflösung gearbeitet werden, man muss dabei jedoch wissen bzw. vermuten, welcher Bereich des Genoms betroffen ist.

Andererseits können die klassische Zytogenetik oder auch die CGH-Technik das gesamte Genom abdecken, aber die Auflösung ist durch den Einsatz des Lichtmikroskops auf ca. 5 Mb beschränkt.

Index

:: Definition
:: Tumordiagnostik
:: Postnatale Diagnostik
:: Pränatale Diagnostik
:: Methode
:: Befundung und Einschränkung
:: Quellenangabe
:: weiterführende Artikel 


Begriffe

Genom

der haploide Chromosomensatz und die in ihm lokalisierten Gene, d.h. die Erbsubstanz eines Organismus

CGH

comparative genomic
hybridization: Vergleichende Hybridisierung von Patienten- und Referenz-DNA an Metaphase-Chromosomen

:: Tumordiagnostik

Die Array- CGH ist also eine Technik, bei der das komplette Genom eines Patienten mit hoher Auflösung auf Abweichungen von der normalen Gendosis untersucht werden kann. Sie gewinnt als innovative Screening-Methode zunehmend an Bedeutung, wobei sie zuerst vor allem in der Tumordiagnostik eingesetzt
wurde. Denn die Tumorprogression ist durch eine Akkumulation von Aberrationen gekennzeichnet, die mit einer Amplifikation von Onkogenen und einer Deletion von Tumorsuppressorgenen einhergehen können. 

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:: Postnatale Diagnostik

Ein weiteres Einsatzgebiet ist die Identifizierung und Charakterisierung von chromosomalen Aberrationen bei Patienten mit angeborenen Fehlbildungen, insbesondere Skelettfehlbildungen, und/oder mentaler Retardierung, die einen unauffälligen Chromosomenbefund zeigen.

Der Einsatz von hochauflösenden molekular-zytogenetischen Methoden wie der Array-CGH erlaubt die genomweite Detektion von submikroskopischen Chromosomenveränderungen wie Mikrodeletionen oder Mikroduplikationen, sowie die genaue Bestimmung von chromosomalen Bruchpunkten bei unbalancierten Strukturaberrationen.  

Vorteile 

Bei der klassischen Zytogenetik finden sich bei Patienten mit mentaler Retardierung und zusätzlichen Dysmorphiezeichen oder familiärer Häufung in 5 % der Fälle lichtmikroskopisch sichtbare Aberrationen. Mittels Subtelomerscreening durch FISH oder MLPA kann in weiteren 5 % der Fälle eine Ursache gefunden werden. Neueste Untersuchungen zeigen, dass die Array-CGH mit einer Auflösung von etwa 1 Mb bei Patienten mit unauffälligem Karyotyp und negativem Subtelomerbefund in 10-15 % der Fälle genomische Imbalancen aufdeckt.

Neben dem Entdecken neuer Imbalancen kann mittels Array-CGH bei zytogenetisch sichtbarem Verlust oder Zugewinn von chromosomalen Bereichen die Größe der Deletion, die Lage der Bruchpunkte oder der Ursprung des zusätzlichen Materials exakt bestimmt werden. Dadurch ist eine genaue Genotyp-Phänotyp-Korrelation und eine Identifizierung von Genen, die an der Entwicklung von mentaler Retardierung und Dysmorphien beteiligt sind, möglich.

Bei einigen bisher in der klassischen Zytogenetik als "balancierte" Translokationen befundete, chromosomale Auffälligkeiten konnte durch Array-CGH nachgewiesen werden, dass im Bereich der Bruchpunkte genetisches Material deletiert oder dupliziert ist und somit eine unbalancierte Translokation vorliegt.

Nachteile 

Auch wenn mit Hilfe der Array-CGH zytogenetische Befunde präzisiert und korrigiert werden können, bleibt die Karyotypisierung weiterhin ein wichtiger Bestandteil der humangenetischen Diagnostik.

Nicht alle chromosomalen Veränderungen sind mit der Array-CGH nachweisbar: Polyploidien, echte balancierte Translokationen und Mosaikzustände mit geringem Anteil aberranter Zellen.

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:: Pränatale Diagnostik

Die erweiterte pränatale Diagnostik soll zusätzliche Informationen über chromosomale Auffälligkeiten geben. Karyotypisierung und FISH-Analyse sind Standard in der pränatalen Diagnostik chromosomaler Störungen. Dabei wird das Genom auf numerische sowie strukturelle Veränderungen untersucht bzw. werden gezielt Bereiche im Rahmen der FISH-Untersuchung genauer betrachtet.

Die Array-CGH verbindet diese beiden Techniken. Mit sehr hoher Auflösung werden alle Chromosomen auf Veränderungen in der Gendosis, sprich: der Menge an genetischem Material, untersucht und bringt somit die Information von "tausenden von FISH-Tests" gleichzeitig. 

Bei sonographischen Auffälligkeiten des Feten oder bei einem auffälligen Chromosomenbefund kann die Array-CGH zur näheren Abklärung indiziert sein. Wenn etwa eine elterliche balancierte Chromosomenveränderung vorliegt kann durch die Array-CGH eine Bruchpunkt-Analyse durchgeführt werden. Submikroskopisch kleine Deletionen und Duplikationen, die die Ursache von mentaler Retardierung und /oder  genetischen Fehlbildungssyndromen sein können, sind mit der Array-CGH diagnostizierbar.  

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:: Die Methode

Hierbei wird die konventionelle CGH-Technik kombiniert mit den Erfahrungen aus der Expressionsanalyse mittels Mikroarrays: Als Hybridisierungstargets dienen auf der Oberfläche eines Glasobjektträgers immobilisierte definierte DNA-Fragmente, wobei der Begriff "Array" sich auf die regelmäßige, rasterförmige Anordung dieser Fragmente bezieht.

Die Fragmente sind so ausgewählt, dass sie das menschliche Genom möglichst gleichmäßig abdecken. An diese binden die zugehörigen Abschnitte der zu untersuchenden DNA, die zur Analyse mit einer genomischen Referenz-DNA verglichen wird. Für die Analyse werden etwa gleiche Mengen der Patienten- und der Referenz-DNA auf dem Array kohybridisiert. Da die DNA-Proben von Patient und Referenz mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, führt eine numerische Veränderung im Patientengenom über eine Verschiebung im Hybridisierungsverhältnis zu einer Farbverschiebung des Fluoreszenzsignals  einzelner Fragmente.

Mit Hilfe eines Scanners werden die Fluoreszenzsignale detektiert und die Farbverschiebungen registriert. Je nachdem wie stark das eine oder das andere Fluoreszenzsignal ist, kann man feststellen, ob beide DNAs gleich gebunden haben, oder eine mehr bzw. weniger. Dadurch lassen sich Deletionen oder auch Duplikationen über das gesamte Genom feststellen. Mit entsprechender Software wird den Signalen die Genregion zugeordnet und schliesslich kann man sich das Ergebnis als "eine Art Karyogramm" anzeigen lassen. Man spricht daher auch von "molekularer Karyotypisierung" oder von einer vergleichenden Genomhybridisierung.

Die Anzahl und die Dichte der Fragmente auf dem Array bestimmen die Auflösung der Array-CGH. Aktuell sind Arrays mit einer Abdeckung des gesamten menschlichen Genoms in einer Auflösung von 1 Mb bis hinunter zu etwa 35 kb erhältlich. Durch die stetig steigende Anzahl von Fragmenten pro Array wird sich die Auflösung weiter erhöhen. So können Imbalancen einzelner Gene zuverlässig nachgewiesen werden.

:: Schema - Array-CGH ::

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:: Befundung und Einschränkung

Array-CGH-Studien zeigen, dass das menschliche Genom einen unerwartet hohen Anteil von Bereichen enthält, deren Kopienzahl bei phänotypisch normalen Menschen variiert. Die Größe dieser CNVs ("copy number variations") reicht von einigen Kilobasen bis zu mehreren Megabasen. Schätzungsweise trägt jedes Individuum mindestens 3-11 solcher Variationen.

Wenn nun in der DNA eines Patienten durch Array-CGH Aberrationen gefunden werden, ist es oft spekulativ, ob diese überhaupt für den Phänotyp verantwortlich sind. Dies kann der Fall sein, wenn z.B. Deletionen oder Duplikationen im Genom gefunden werden, die in der Literatur bisher noch nicht beschrieben sind.

In der Regel werden bei Auffälligkeiten im Array auch die Eltern untersucht, um festzustellen, ob die Deletion oder Duplikation neu (de novo) entstanden ist, oder ob bereits ein Elternteil diese chromosomale Veränderung trägt. Solche Situationen machen deutlich, wie wichtig in diesen Fällen eine genetische Beratung und die intensive Auseinandersetzung mit der individuellen Situation sind.

Die Wahrscheinlichkeit, dass eine chromosomale Aberration krankheitsverursachend ist, steigt

· mit der Größe der Aberration
· wenn sie "de novo" vorliegt, die Eltern diese Aberration also nicht tragen
· wenn sie in keiner Datenbank für Polymorphismen aufgeführt ist
· wenn Gene betroffen sind, die mit dem beobachteten Phänotyp in Verbindung gebracht werden können
· wenn Fälle mit gleicher oder ähnlicher Aberration bekannt sind, die einen ähnlichen Phänotyp zeigen

 Erkannt werden können nur "Zugewinne" oder "Verluste" von genetischem Material. Balancierte Translokationen oder Inversionen können nicht entdeckt werden. Auch Punktmutationen oder Basenveränderungen, die die Ursache von vielen monogenen Erkrankungen sind, wie z.B. Mukoviszidose oder Skelettdysplasien, können mit der Array-CGH nicht gefunden werden. Bestimmte Mosaike oder z.B. weibliche Triploidien können ebenfalls nicht erkannt werden. 

Je mehr die Array-CGH in der klinischen Diagnostik eingesetzt werden wird, desto eher wird sich auch das Array-Design an die Ansprüche dieses Bereichs anpassen: Durch eine Vermeidung bekannter CNV-Regionen und eine Bevorzugung von chromosomalen Bereichen und Genen, die bei mentaler Retardierung und Dysmorphiesyndromen eine Rolle spielen, werden die Arrays für die prä- und postnatale Diagnostik in Zukunft immer interessanter werden.

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:: Quellenangabe

· Array-CGH für die klinische Diagnostik

Vortrag am 4. Zytogenetik Forum Österreich, 12. April 2008

Univ.Prof.Dr. Michael Speicher
Institut für Med. Biologie und Humangenetik der Universität Graz
Harrachgasse 21/8
8010 Graz

Internetquellen:

:: Genomweite Suche nach Mikroaberrationen: Array-CGH ::

:: Weiterführende Artikel

:: CGH - Comparative Genomic Hybridisation (vergleichende genomische Hybridisierung) ::