Multicolor Banding (mBAND)

:: Entstehung ::

Ein wichtiger Faktor in der klinischen Genetik ist, eine möglichst präzise Charakterisierung von Chromosomenaberrationen durchzuführen, um eine Korrelation zwischen Genotyp und Phänotyp herstellen zu können. Dies kann zu prognostischen Zwecken herangezogen werden und zur Erstellung von kartographischen Chromosomendateien beitragen, um eine immer genauere Aufklärung chromosomenbedingter Entwicklungs- störungen zu erreichen.

Um vor allem intrachromosomale Aberrationen abklären, exakte Bruchpunktbestimmung durchführen und komplexe Rearrangements darstellen zu können mussten die Limitierungen der vorhandenen Methoden aufgehoben werden, indem eine Bänderungstechnik entwickelt wurde, die hochauflösender war als die bisher bekannten.

Index

:: Entstehung
:: Die Methode
:: Qualität und Probleme
:: Auswertung
:: Quellenangabe

:: Die Methode

Die Methode des Multicolor Banding (mBAND) wurde erstmals 1999 beschrieben. mBAND erlaubt die Unterscheidung regionen-spezifischer Bereiche eines Chromosoms auf dem Level der konventionellen chromosomalen Banden. Die Technik basiert auf dem Gebrauch unterschiedlich markierter, überlappender Mikrodissektionsbibliotheken, sogenannter regionspecific partial chromosome paints (RPCPs).

Die wechselnden Fluoreszenzintensitäten entlang eines Chromosoms werden benutzt, um verschiedene Falschfarben für spezifische chromosomale Bereiche zu generieren. Eine mBAND-Sonde ist immer spezifisch für ein Chromosom.

Herstellung der Sonden

Zuerst mussten bei der Herstellung einer mBAND-Sonde die RPCPs mit Hilfe der Mikrodissektion erstellt werden. Bei der Mikrodissektion handelt es sich um eine Methode, die es unter mikroskopischer Sicht erlaubt, mit einer feinen Glasnadel Chromosomen an beliebigen Stellen zu schneiden und die geschnittenen Stücke separat zu sammeln. Je nach Größe des Chromosoms erhält man zwischen drei und acht Mikrodissektionsbibliotheken pro Chromosom, die so gewählt sind, dass sie sich zu einem gewissen Grad überlappen. 

Im Handel werden Kits für jedes Chromosom angeboten, basierend auf fünf verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen zur Markierung der RPCPs.

Hybridisierung 

Die Methode entspricht der üblichen Fluoreszenz in situ Hybridisierung, wie sie auch für M-FISH durchgeführt wird.

Siehe dazu auch :: FISH in der Praxis ::

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Auswertung der fluoreszenzmarkierten Metaphasen

Die Auswertung erfolgt an einem Fluoreszenz-Mikroskop mit Hilfe eines computergestützten digitalen Bildanalysesystems.

An einer geeigneten Metaphase wird mit jedem, dem jeweiligen Fluorochrom entsprechenden Filter eine Einzelaufnahme gemacht. Diese wird mittels Kamera in die Software übertragen. Dort werden die angefertigten Bilder automatisch übereinander gelegt, so dass alle Fluorochrome gleichzeitig in einem Bild betrachtet werden können.

Das betreffende Chromosomenpaar aus der Metaphase wird ausgeschnitten und in eine Karyogrammvorlage einsortiert. Die verschiedenen Optionen der Software ermöglichen es, die Auswertung durchzuführen. Zum einen besteht die Möglichkeit, sich die Kurvenverläufe der Fluoreszenzintensitäten entlang des Chromosoms und zeitgleich die einzelnen fluoreszierenden Bereiche sowie die DAPI-Gegenfärbung anzeigen zu lassen.

Zum anderen besteht die Möglichkeit, das Chromosom in Bereiche ähnlicher Fluoreszenz- und Fluoreszenz-kombinationsintensitäten einzuteilen. Dies geschieht vollautomatisch und den so berechneten Bereichen werden verschiedene sogenannte "Falschfarben" zugeordnet. Das Ergebnis dieser Berechnungen wird als Falschfarben-Klassifikator bezeichnet.

Die Anzahl der zu generierenden Falschfarben kann frei gewählt werden. Bei zu hoher Anzahl gewählter Falschfarben passiert es, dass die Software nicht so viele Bereiche im Verlauf des Chromosoms unterscheiden kann und deshalb manche der Falschfarben nicht angezeigt werden.

Der Klassifikator wird bei jeder Hybridisierung erneut erstellt. Die Berechnung des Klassifikators geschieht immer an dem nicht aberranten Chromosom, wird dann aber auf beide Chromosomen eines Paares angewandt.

Die Auswertung und Interpretation der Hybridisierungsergebnisse mit den chromosomspezifischen mBAND-Sonden erfolgt unter Nutzung dieser Software-Möglichkeiten und der Kenntnis des bei der Herstellung der jeweiligen Sonde zugrunde liegenden Markierungsschemas.

:: Beispiel mBand ::

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:: Qualität und Problemfälle

In der Literatur wird beschrieben, dass die Hybridisierung mit mBAND-Sonden weniger stark von der Qualität der zugrunde liegenden Metaphase abhängig ist wie die klassische GTG-Bänderung. (Lemke et al., 2001 - siehe auch :: weiterführende Artikel ::)

Bei einem Großteil der Fälle, bei denen es zu unzureichenden Hybridisierungsergebnissen kommt, liegt eine auch für mBAND unzureichende Qualität der zugrunde liegenden Metaphasen vor. Insbesondere kann bei Chromosomen, die nach mehrjähriger Lagerungszeit hybridisiert wurden, oftmals keine zytoplasmafreie Präparation erfolgen, so dass keine optimale Anlagerung der mBAND-Sonden erreicht wird.

Den Grund hierfür liefert die Essigsäure als Bestandteil der in der Chromosomenpräparation verwendeten Fixativ-Mischung. Trotz ihrer nur schwach sauren Eigenschaften kommt es zu einer Acetylierung chromosomaler Proteine. Unter trockenen Bedingungen weist Essigsäure demnach eine starke Bindung zu dem an Protein heftenden Wasser auf. Dieser Prozess führt während einer langen Lagerung der Chromosomensuspension in Fixativlösung, wie sie zur Asservierung routinemäßig angewandt wird, zu einer Schädigung der chromosomalen Strukturen und somit zu einer verminderten Hybridisierungsqualität.

Erfahrungen zeigen, dass eine Lagerung von Chromosomen in Fixativ über einen Zeitraum von mehr als fünf Jahren als kritisch betrachtet werden kann, da alle erfolgreichen Hybridisierungen stets nur mit Chromosomensuspensionen erzielt wurden, die weniger lang asserviert wurden.

Schlechte Hybridisierungsergebnisse können sich auch durch eine mangelhafte Qualität der Sonden ergeben. Wiederholung von Hybridisierungen mit neuen Chargen von mBAND-Sonden sei bei schlechten Ergebnissen auf jeden Fall angeraten.

Auch schwache Signale bzw. ein kompletter Ausfall des FITC-Signals kommen immer wieder vor. Markierungen von DNA-Proben mit dem Fluorochrom FITC erweisen sich im Vergleich zu anderen Fluorochromen häufig als schwierig und instabil. Insbesondere pH-Wert-Schwankungen führen zu einer unzureichenden Beladung der DNA Segmente mit Fluoreszenzfarbstoff. 

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:: Auswertung

Die Auswertung der mBAND-Analysen erweist sich wie die Durchführung der Hybridisierung nach einer anfänglichen Einarbeitungsphase als prinzipiell einfach durchzuführen. Lediglich Einzelfälle zeigen sich als problematisch.

Anzahl der Falschfarben 

Bei der vollautomatischen Anwendung von Falschfarben bringt die beliebige Wahl der Anzahl an Farben ab einem gewissen Grad keine Verbesserung der Auflösung mehr. Im Gegenteil: Bei zu hoher Zahl an gewählten Falschfarben ergibt sich eine unübersichtliche Bänderung des Chromosoms. Zudem fällt in diesen Fällen eine fehlende Repräsentation einzelner Falschfarbenbereiche auf dem Chromosom auf.

Dieser Effekt beruht auf den algorithmischen Formeln der Software zur Berechnung der Falschfarbenbereiche und den dazugehörigen Fluorochromintensitäten, die ab einem gewissen Grad keine Einteilung in noch kleinere Bereiche zulassen, so dass gewissen Falschfarben keine Entsprechung eines Fluorochromintensitätsmusters zuzuordnen ist.

Komplexe Aberration 

Bei komplexen Umbauten kann eine Vermischung von Fluoreszenzsignalen die Auswertung erschweren. Dieses Phänomen wird als "flaring" bezeichnet. Dabei handelt es sich um eine technische Begrenzung des Bildanalysesystems, das durch die algorithmische Interpretation von Fluoreszenzüberlagerungen zu
Missinterpretationen der Fluoreszenz in situ Hybridisierung führen kann.

So wurde bei der Anwendung von SKY oder M-FISH an Translokationschromosomen beschrieben, dass es am Bruchpunkt der Translokation, an der die beiden unterschiedlich fluoreszierenden Chromosomensegmente aufeinander stoßen, zum sogenannten flaring kommt. Dadurch entsteht der Eindruck, dass neben den beiden Chromosomen ein drittes, nicht homologes Segment an dem Strukturumbau beteiligt ist.

Derselbe Effekt tritt auch beim Multicolor Banding auf. Bei der Analyse einer Translokation mit mBAND und chromosomalem Painting am Bruchpunkt der beiden Chromosomen, an dem die verschiedenen Fluoreszenzsignale aufeinander treffen, fällt das Auftreten einer irregulären Falschfarbenbande auf.

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Terminal gelegene Aberration

Ein weiterer auffälliger Aspekt bei der Auswertung der mBAND-Hybridisierungen zeigt sich am Ende der Chromosomen. Die Falschfarbenbanden meist breiter erschienen als die zentromernah gelegenen Bereiche. Damit ist die Aussagekraft der Falschfarbenanwendung in den Endbereichen geringer, da diese nicht so hoch auflösend sind wie in den mittleren Bereichen der Chromosomen. Dies führte zu Schwierigkeiten in der Analyse des Karyotyps bei terminal gelegenen Aberrationen.

Als Erklärung für dieses Phänomen dient die automatische Konturenerkennung der Chromosomen bei dem Prozess der Karyotypisierung durch die zur Verfügung stehende Software. Diese Programmroutine ermittelt die Kontur eines Chromosoms anhand der DAPI-Gegenfärbung. Fluorochromsignale jenseits dieser Konturen
gehen bei diesem Prozess verloren. Da die DAPI-Färbung an den Enden der Chromosomen häufig weniger intensiv ist, kann besonders dort Fluoreszenzinformation verloren gehen und eine geringere Differenzierbarkeit mit der Gefahr einer Fehlinterpretation aufweisen.

Fazit 

Die Methodik des Multicolor Banding kann also unter Beachtung gewisser Hinweise prinzipiell als verlässlich und reproduzierbar angesehen werden. Sie kann in allen zyto- und molekularzytogenetisch ausgerichteten Laboren problemlos durchgeführt werden. Allerdings sollte wegen der oben genannten technischen Schwierigkeiten der Multicolor FISH nie auf das alleinige Durchführen einer solchen Technik gesetzt werden. Die Analyse aberranter Karyotypen sollte durch weitere molekularzytogenetische Methoden oder klassische Färbemethoden ergänzt werden .

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:: Quellenangabe

· Multicolour Banding zur Abklärung intrachromosomaler Aberrationen

Inaugural-Dissertation, Marburg 2007 

Ingo Zimmermann
Lennestadt, Marburg