FISH in der Praxis

:: Definition ::

Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) ist eine Methode um genetische Veränderungen im Gewebe auf Einzelzellbasis in intakten Zellen bzw. Chromosomen, also in situ, nachzuweisen.

Als Hybridisierung bezeichnet man allgemein die Verschmelzung von zwei komplementären, also genau zueinander passenden, einsträngigen Nukleinsäuresträngen. Man muss also zum Nachweis einer bestimmten DNA- oder RNA-Sequenz eine entsprechende komplementäre Sequenz, die sogenannte Gensonde herstellen.

siehe dazu auch die Artikel der Rubrik Theorie
:: Fluoreszenz in situ Hybridisierung ::
:: FISH - verschiedene Techniken ::

Index

:: Definition
:: Arten von Gensonden
:: Vorbehandlung
:: Denaturierung
:: Hybridisierung
:: Waschschritte
:: Detektion
:: Auswertung
:: Befundung
:: Tipps
:: Quellenangabe
:: Färberezept

:: Arten von Gensonden

· Painting Sonden – für Whole Chromosome Paint (WCP), nicht geeignet für die Telomerbereiche, Einsatzgebiet Translokationen (für balanzierte Träger, Nachweis unbalanzierter Aberrationen)
· Zentromersonden – zum Chromosomenzählen, Interphase (Pränataler Schnelltest)
· Dual color / break apart - Nachweis typischer Translokationen (Bestimmung von Genregionen) in der Tumorzytogenetik
· Dual color / dual fusion – dasselbe Einsatzgebiet wie break apart-Sonden
· Telomersonden – Bestimmung des konstitutionellen Karyotyps, für diskrete Deletionen in der Postnataldiagnostik (z.B bei Kindern)
· Lokusspezifische Sonden - Einzelsonden zum Nachweis von Mikrodeletionen (1 Farbe Kontrollsonde, 2. Farbe für den Locus)

Painting Sonden (WCP)

Painting FISH (WCP)Painting Sonden werden aus isolierten Chromosomen hergestellt. Ganze Chromosomen aus Metaphasenpräparaten oder Teile davon lassen sich durchflusszytometrisch bzw. durch zusätzliche Mikrodissektion isolieren und für die isH als Gensonden verwenden. Diese aufwändig herzustellenden Sonden werden nur zur FISH-Analyse von ganzen Chromosomen eingesetzt.

· Nachweis von Translokationen
· bei multiplen Chromosomenrearrangements
· Untersuchung von Markerchromosomen
· Telomertranslokationen sind mit WCP nicht nachweisbar

Bei Translokationen, bei denen nur ganz wenig Genmaterial (z.B. Telomerbereich von Chromosom 14 Genlocus IGH) vertauscht ist, kann es sein, dass diese Region nicht leuchtet und mit WCP nicht sichtbar ist (dafür spezielle Genlocussonden verwenden).

Dual Color/single fusion

dual color/single fusionHerbei handelt es sich um eine Mischung von zwei Gensonden (eine rot, eine grün), die jeweils nur an einer Seite der beiden Bruchpunkte bei einer Translokation ansetzen.

Bei fehlender Translokation sieht man 2 rote und 2 grüne Singlesignale, bei Vorhandensein einer Translokation findet man je 1 einzelnes rotes und 1 grünes Signal sowie die Translokation als Fusionssignal aus beiden Farben (auf jenem Chromosom, auf dem sich die Bruchpunktregionen befinden).

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Dual color/dual fusion

Es handelt sich dabei um eine Mischung zweier Einzelsonden (grün und rot), die jeweils einen bestimmten Bruchpunkt überspannen (Dual color/dual fusion probe = Punktsonden (LSI)).

Hier umspannen die Gensonden die typischen Bruchpunktregionen eines bekannten Translokationstyps, sodass bei einer stattgefundenen Translokation das Fusionssignal auf beiden translozierten Chromosomen zu finden ist, weil sich die markierten Regionen durch die Translokation aneinander angelagert haben.

Die beiden normalen Chromosomen weisen jeweils nur eine der beiden Farben auf.

Typische Beispiele:

· BCR/ABL der Translokation t(9;22)(q34;q11) der CML

· IGH/MYC der Translokation t(8;14)(q24;q32) des Burkitt-Lymphoms. Hier sind die Genregionen bekannt – z.B. C-MYC-Gen ist der typische Bruchpunkt beim Burkitt-Lymphom mit t(8;14) auf dem Chromosom 8 sowie der Bruchpunkt in IGH des Chromosoms 14. Bei der Translokation sind die Bruchpunkt beider Regionen somit jeweils auf den veränderten Chromosomen 8 und 14 zu finden.

LSI MYC 8q24 Region rot
LSI IGH 14q32 Region grün

dual color/dual fusionDual fusion probe – bei der Translokation wird jeweils ein Chromosom 8 und ein 14 mit je einer spezifischen Signalfarbe markiert und ein Derivativ 8 und ein Derivativ 14 Chromosom mit je einem rot/grünen aneinandergelagerten Doppel-Signal (Austausch von Teilen der Genregion, der Bruchpunkt findet sich inmitten der betroffenen Genregion).

Sind die Punktsignale bei typischen Translokationen nicht wie erwartet, dann kann der Bruch auch oberhalb oder unterhalb des typischen Genlocus stattgefunden haben.

Bei genspezifischen Sonden muss von der Firma angegeben sein, welche Regionen umfasst sind. Kann in der Interphase bei typischen Translokationen auch beurteilt werden, beweisend ist aber die Metaphase.

Vorteil zur PCR: die Sonde, z.B.MYC, umfasst auch kleine Bereiche
Nachteil: für FISH braucht man viel mehr Material als für die PCR

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Dual color / break apart

Eine Zweifarbensonde, deren Genregionen im Bruchpunktbereich zweifärbig markiert wurden. Die Sonden werden um den Bruchpunkt herum gelegt (eine Farbe zentromerwärts des Bruchpunkts, zweite Farbe telomerwärts). Im Fall einer Translokation werden die Farben getrennt.

Chromosom 14q32 Genregion IGH
IGH cen / rot
IGH tel / grün

dual color/break apartIst das rot-grüne Doppelsignal gesplittet hat eine Translokation in der IGH-Region am Telomer 14 stattgefunden. Findet sich keine Translokation, sind zwei rotgrüne Fusionssignale für jedes Chromosom/Genregion zu sehen.

In der Interphase ist die Translokation damit noch nicht nachgewiesen (fehlt ein Signal, kann dies auch eine Deletion sein).


Weiteres Beispiel

11q23-Anomalien (MML-Gen) der akuten lymphatischen Leukämie (AML)

Bei Translokationen mit mehreren Partnergenen eignet sich eine break apart-Sonde, um distal und proximal die Genregionen des Bruchpunkts zu markieren (Fusionssplittung = Translokation). Das Fusionssignal (1 Genregion wird mit 2 Farben markiert) ist für 11q23 (rot/grün) – wenn das Fusionssignal gesplittet wird, dann hat ein Bruch in 11q23 stattgefunden = Translokation (man weiß nur nicht, welches 2. Chromosom involviert ist).

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:: Vorbehandlung

Fixation von Chromosomenpräparaten (Zellsuspension)

1) Fixativ
2) Auftropfen
3) Lufttrocknen

Aufgrund der für die Anfertigung von qualitativ hochwertigen Metaphasen-Präparationen notwendigen Materialverarbeitung (hypotone Behandlung, anschließend Fixierung in Methanol/Eisessig) sind diese Präparate bereits vorbehandelt.

Metaphasenpräparate sind meist direkt einer FISH-Analyse zugänglich, in der Regel benötigen sie als Vorbehandlung lediglich eine Nachfixierung in Methanol/Eisessig mit anschließender Dehydrierung.

Tipps:

Objektträger (Metaphasen) mind. 2 h vorher auftropfen, in 60°C Brutschrank zum Altern (vor allem wenn Plasmasaum zu sehen ist).
WICHTIG: unbeschichtete OT verwenden (KEINE Superfrost, am besten normale MENZEL)
Besser: über Nacht trocknen (können 1 bis 2 Tage problemlos bei Raumtemperatur (RT)im Dunkeln liegen, ansonsten bei –20°C in Alufolie gepackt einfrieren)

Zytologisches Material (nativ)

1) Lufttrocknung bei RT 24h
2) Aufbewahrung bis zur Verwendung in trockener Atmosphäre in luftdicht verschlossenen Behältern bei –20°C
3) Fixierung vor der Verwendung mit Methanol/Eisessig
4) Alkoholreihe
5) Trocknen

Gewebeauflockerung (Permeabilisierung von zytologischen Präparaten und für Interphase)

1) 2xSSC bei 73°C 2 min
2) Andauung Pepsin 10 min
3) In Phosphatpuffer waschen
4) Mit 1% Formaldehyd nachfixieren (konz. Formamid in Phosphatpuffer verdünnen) – kann man auch weglassen
5) Alkoholreihe

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:: Denaturierung

Denaturierung der DNA

Im ersten Schritt wird die einsträngige Proben-DNA (Metaphase-Chromosomen oder Interphasen-Kerne) denaturiert - ein Prozess, der die Komplementärstränge innerhalb der DNA-Doppelhelix in Einzelstränge trennt.

Der Denaturierungsprozess findet durch Hitze statt. Die Denaturierungstemperatur sollte etwa um 25°C über der theoretischen Schmelztemperatur liegen. Die Effizienz der Auftrennung ist auch von der Dauer der Denaturierung abhängig, die ermittelten Zeiten (zwischen 1 bis 5 Minuten) sollten damit ebenso wie die Temperatur genau eingehalten werden.

Beim Schmelzpunkt von 80°C ist die Hälfte der DNA denaturiert. Formamid in der Denaturierungslösung erniedrigt den Schmelzpunkt der DNA künstlich.

· Dabei gilt: Pro 1% Formamid wird der Schmelzpunkt um 0,7°C erniedrigt. Idealerweise werden die Chromosomen durch Erhitzen auf 73°C einzelsträngig gemacht.

Prinzipiell können Ziel-DNA und Sonden gemeinsam (Co-Denaturierung) oder getrennt denaturiert werden. Bei der getrennten Denaturierung werden die Präparate im Wasserbad erhitzt und in SSC-gepufferter Formamidlösung denaturiert. Der fertige Sondenmix wird extra in einem Reaktionsgefäß denaturiert.

Bei der Co-Denaturierung wird der fertige Sondenmix auf das Präparat aufpipettiert und auf einem Hybridisierungsgerät (Hybrite, Fa. Vysis) gemeinsam mit dem Gewebe denaturiert.

Stringenz

Beeinflussend für die Denaturierung sind alle Faktoren, die zu größerer Schärfe führen = Stringenz. Dazu gehören:

· pH-Wert der Denaturierungslösung
· Formamidkonzentration
· Temperatur
· Anzahl der repetitiven Basensequenzen im Färbebereich des Chromosoms
· Basengehalt in der Sonde (GC kleben besser)

Für Zentromersonden braucht man eine höhere Stringenz als bei den Painting-Sonden

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:: Hybridisierung

Eine fluoreszenz-markierte DNA-Sonde wird anschließend der denaturierten Probe zugeführt und hybridisiert mit der Proben-DNA. Die Sonden sind entweder direkt mit einem Fluorophor wie z.B. FITC, Texas Rot etc. oder indirekt mit einem Hapten, meist Biotin oder Digoxigenin, markiert.
Hybridisierung bedeutet eine präzise Anlagerung der einsträngigen DNA-Sonde an die komplementären Targetsequenzen der Proben-DNA, wodurch sich die beiden Einzelstränge wieder zu einer Doppelhelix verbinden.

Wichtig ist dabei die richtige Probenkonzentration – ideal ist ein Probenüberschuss. Die Probenlänge (Menge) an Basenpaaren liegt idealerweise bei 200-300. Die Menge der benötigten Sondenlösung hängt von der Hybridisierungsfläche ab. Zur Verringerung des Reagenzienbedarfs bedeckt man die Sonde mit einem Deckglas und versiegelt dieses mit Flüssiggummi (Fixogum).

Deckglasgröße Sondenmenge
22x22 mm 10 ul
18x18 mm 7 ul
15x15 mm 5 ul
12x12 mm 4 ul
12mm Ø 3 ul
10 mm Ø 2 ul

Die Hybridisierung erfolgt bei 25°C unter dem Schmelzpunkt (idealerweise bei 37°C) sollte mindestens 4 Stunden dauern, praktikabel ist eine längere Hybridisierungszeit von mindestens 16 Stunden (über Nacht).

Begriffserklärung:

Hapten = meist niedermolekulare, chemisch definierte Substanz
Komplementarität = nicht komplexe Basenpaare
Renaturierung = 2 zusammengehörige Einzelstränge kommen zusammen
Hybridisierung = 1 Strang ist fremd

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:: Waschschritte

Stringentes Waschen mit SSC - das bedeutet, dass nach der Hybridisierung überschüssiges und ungebundenes Sondenmaterial durch mehrere Waschschritte entfernt wird und somit die Hintergrundfärbung minimiert werden kann.

Auch hier kann man die Intensität der Waschschritte durch Veränderung der Stringenz der Waschlösungen (Variantion der Temperatur bzw. Zugabe von Formamid) und durch die Dauer der stringenten Waschung steuern.

Verwendet wird ein SSC-Puffer mit NP40 (Detergens) und Formamid. Die Höhe des Formamidgehalts in den Waschlösungen ist wichtig für die Funktion der Sonden.

Stringenz

Wichtig und variabel für die Steigerund der Färbeintensität:

· Temperatur - erhöhen
· Formamidbeigabe - erhöhen
· Salzkonzentration - verringern
· Zeit – wenn zu kurz entsteht Hintergrundfärbung
         – wenn zu lang > schwaches Signal

Bei Kombination von Zentromersonde mit einer Fusions-Sonde muss man die Salzkonzentration des Puffers anpassen.
Bei Kombination von CEP und LSI-Sonden unbedingt einen Hybridisierungspuffer mit niedriger Formamid-Konzentration nehmen!

Waschen ohne Formamid ist nur bei 72°C möglich, kann aber für die Zellen zu aggressiv sein. Man hat dann zwar keine Hintergrundfärbung (im HG befinden sich genähnliche Sequenzen, die Sonden halten dort schlechter und werden weggespült), aber auch die Signale sind schwächer.

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:: Detektion

Gegenfärbung und Eindeckmittel

Die Zellkerne werden mit einer DNA-spezifischen, blau floureszierenden DAPI (4,6 Diamidino-2-phenylindol)-Färbung gegengefärbt. Anschließend erfolgt die Sichtbarmachung der gebundenen Sonde über die Fluoreszenzfarbstoffe (Biotin, Digoxigenin,...) mittels eines Fluoreszenzmikroskops, umso die Proben-DNA auf Vorhandensein oder Absenz des betreffenden Signals auszuzählen.

DAPI-Konzentration

DAPI für Triple Filter bei locusspezifischen Sonden soll nicht zu stark sein.

DAPI I nur für Paraffinschnitte
DAPI II für Metaphasen und Zytopräparate
DAPI III für CGH

DAPI von Vectashield
Hält bei –20°C bis zu einem Jahr die Floureszenzsignale und ist 1:1 verdünnbar mit Vectashield ohne DAPI.

Zur Verringerung der Ausbleichung werden dem Eindeckmittel Substanzen beigesetzt, um diesen unvermeidbaren Störfaktor deutlich zu verlangsamen.

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:: Auswertung

Beurteilung der Qualität

Das gefärbte, eingedeckt Präparat in mittlerer Vergrößerung (20x und 40x Objektiv) durchmustern. Die DAPI-gefärbten Kerne bzw. Chromosomen sollten kräftig leuchten, ein zytoplasmatischer Hintergrund kaum oder gar nicht sichtbar sein. Die FISH-Signale sollten als kleine, hell leuchende, gut abgegrenzte Signale gerade erkennbar sein.

Analyse der Präparate

Die eigentliche Auswertung erfolgt bei hoher Vergrößerung (60x oder 100x Immersionsobjektiv). Zellen sind in der Interphase mit 60x Objektiv besser erkennbar, weil die Signale eher in einer Ebene liegen (bessere Tiefenschärfe als das 100x Objektiv).

Bei der Auswertung ist wichtig, nur einzeln liegende Zellen mit klaren FISH-Signalen zu evaluieren, überlappende Zellkerne dürfen ebenso wie Kerne mit diffusen oder fehlenden FISH-Signalen nicht ausgewertet werden.

Nach der Auswertung können die Präparate luftdicht verpackt bei –20°C aufgehoben werden und sind so mindestens 6 Monate haltbar.

Interphase

Die DNA liegt im Kern randomisiert (willkürlich) verteilt vor – daher ist eine Signal-Aneinanderlagerung möglich, die nichts mit einer Translokation oder Dual Fusion zu tun hat. Aus diesem Grund muss ein Cut off –Level bestimmt werden. Wenn z.B. nur wenig Tumorzellen in einem Gewebe zu finden sind (z.b. nur 6%) und man hat einen cut off von 7%, dann ist die Interphase-FISH sinnlos.

Ein Cut off level sollte immer vor der Benutzung einer neuen Sonde festgelegt werden. Dazu werden 20 Objektträger gefärbt und ein Prozentsatz ausgerechnet:

· wie viele falsche Signale treten bei normalem Patienten auf
· wie oft nur 1 Signal, wie oft 3 Signale statt 2

Der Durchschnittswert ist der cut off - dazu die Variationen nach oben und unten anmerken und folgende Punkte vermerken:

· wie groß darf der Abstand zwischen den Signalen sein
· wie groß muss die Anzahl der beurteilten Kerne sein
· in normalen Zellen lagern sich die Signale auch gern aneinander – wenn ein Signal gesplittert ist, ab welchem Abstand liegen sie aneinander bzw. sind getrennt (Zentromersonden können leicht zerreißen, weil das Zentromer größer als eine Genregion ist, und dann wie zwei Signale aussehen)

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:: Befundung

Befunderstellung

Im schriftlichen Befund sollte klar und auch für molekulargenetische Laien verständlich der Nachweis oder das Fehlen der gesuchten genetischen Veränderung angeführt werden. Zur besseren Vergleichbarkeit der Daten sollte die eingesetzte Methode und Herkunft der Gensonden angeführt werden.
Eine verpflichtende Fotodokumentation aller FISH-Präparate ist derzeit gesetzlich nicht vorgeschrieben. (Stand 2005)

Nomenklatur (Karyotypformel FISH)

ISCN 2005- An International System for Human Cytogenetic Nomenclature

Autor: Lisa G. Shaffer, Niels Tommerup
Verlag: Karger
ISBN 3-8055-8019-3

FISH wird hinter dem Karyotyp mit dem Symbol ish angefügt.

Lokusspezifische Sonden

46,XX.ish del(22)(q11.2q11.2)(D22S75-)

Deletion wird mit einem Minus (-) angegeben - der Lokus, den die Sonde markiert, fehlt - spricht für eine Mikrodeletion

Genspezifische Sonden

46,XX.ish del(17)(p11.1p11.2)(CMTA1-)
Deletion wird mit einem Minus (-) hinter der sondenspezifischen Genregion angegeben

46,XY.ish dup(17)(p11.2p11.2)(CMTA1++)
Duplikation wird mit einem Doppelplus (++) hinter der sondenspezifischen Genregion angegeben

47,XY,+mar.ish add(16p or q)(wcp16+)
Angabe, dass der Marker sich mit einer Paintingsonde für Chromosom 16 anfärbt und es sich damit um zusätzliches Material 16 handelt, dessen Lokalität (p oder q-Arm) nicht genau bestimmt werden kann.

46,XY,t(9;22)(q34;q11).ish t(9;22)(ABL-;BCR+,ABL+)
Translokation zwischen Chromosom 9 und 22 betreffend die typischen Bruchpunktregionen BCR/ABL mit zusätzlicher Deletion (im Karyogramm nicht zu sehen) > auf Chromosom 9 fehlt die ABL-Region, auf dem Chromosom 22 sind sowohl BCR als auch ABL vorhanden.

genausogut kann man eine komplizierte ish-Formel im Befund weglassen und stattdessen die Auswertung im Text angeben - z.B. t(9;22)(q34;q11) mit Involvierung von BCR und ABL ... (oder: ein Signal für xxx spricht für xxx)

Interphase

FISH im Zellkern wird mit dem Symbol nuc angegeben

Dual color/dual fusion

nuc ish 9q34(ABL3x),22q11(BCR3x)(ABL con BCR 2x)
3x bedeutete, dass das Signal für die ABL- bzw. BCR-Region 3x vorhanden ist (1x jeweils im normalen Chromosom und je einmal in den betroffenen Derivativchromosomen 9 und 22 der Translokation;
con bezeichnet die Aneinanderlagerung der Signale und bedeutet die Fusion von ABL und BCR in den beiden Translokationschromosomen

dual color/break apart

Hier gilt dasselbe wie für die Dual Fusion-Sonde, doch statt con wird ein sep für sperated angegeben.

Bei der Interphase wird die Anzahl der Zellkerne angeben, die ausgezählt wurden bzw. wieviele von gesamt von der Veränderung betroffen sind. Z.B. Wir haben in xxx (Anzahl) von xxx (Anzahl) Interphasen Fusionssignale gesehen, die xxx (dem) entsprechen.

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:: Tipps zur Färbung

Sonden

Beim Umgang mit den Sonden sowie den gefärbten Präparaten stets auf Dunkelheit achten, FITC (grün) bleicht am schnellsten aus, sehr robust sind die Farben Rot und DAPI.

Beim Fotografieren stets mit grün anfangen und mit DAPI aufhören

3.Farbe

man kann die Sonden rot und grün von 1 Chromosom mischen – wird gelb

Formamid

Formamid ist bei Raumtemperatur zähflüssig
es ist ein gesichertes Mutagen (IMMER Handschuhe tragen, Abzug!)

Versiegeln mit Nagellack

Nicht nötig, wird nur gemacht damit das Deckglas nicht verrutscht (auch für die Aufbewahrung unnötig)
Nagellack hat zudem eine starke, sehr störende Autofloureszenz

Gefärbte Zytopräparate nachfishen

· 1-3 Tage Deckglas + Eindeckmittel in Xylol entfernen
· Giemsa hat eine heftige Autofloureszenz (20 min Fixativ vor der Alkoholreihe bleicht)

G-Banding gefärbte Präparate nachfishen

· mussen nicht entfärbt werden
· einfach in Xylol das Eindeckmittel entfernen und
· im Alkohol entfärbt sich das G-Banding von selbst

Nicht eingedeckte OT nur noch schwer fishbar – Öl stört und die Präparate sind mit FISH nur noch schlecht anfärbbar (sehr lange in Xylol baden versuchen)

noch mal hybridisieren am selben Präparat

· Deckglas seitlich wegziehen
· in PBS oder 2xSSC DAPI wegspülen
· dann beim Alkohol neu beginnen
· kürzer denaturieren (Temperatur und Zeit verkürzen), Waschschritte kurz halten

· bei Metaphasen vorher die Koordinaten markieren, weil sich DAPI beim 2x schwächer anfärbt; manche Chromosomen werden auch weggespült, und auch die ursprüngliche Sonde wird nicht ganz weg sein

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:: Quellenangabe

Die Informationen zu dieser Seite entstammen dem

FISH-Workshop Zytogenetik
1. bis 2. April 2005
Wilhelminenspital, Pavillon 27, Zentrallabor

Veranstalter:
LBV-MTA Wien, NÖ, Bgl. über das Zytogenetik Forum Österreich
Elfriede Hufnagel und Silvia Sladek
in Zusammenarbeit mit
Abbott GmbH, Diagnostics Division
Optoteam GesmbH Nikon Instruments

Kursorganisation und Leitung:
Univ. Doz. Dr. Berthold Streubel
Facharzt für Humangenetik
Inst. für Pathologie, AKH Wien
Währinger Gürtel 18-20, 1090 Wien

OA Dr. Michael Vesely
Facharzt für Pathologie und Humangenetik
Jakob Erdheim Institutu für Pathologie
Krankenhaus Hitzing (Lainz)
Wolkersbergerstraße 1, 1130 Wien

Fotos: © der Bilder liegt bei der Firma Vysis

:: Färberezept

:: Download Färbeanleitung :: (FISH-Protokoll für Metaphasen und M-FISH)

Diese Anleitung wurde im FISH-Workshop Zytogenetik von den Teilnehmerinnen unter Anleitung von Univ.Doz.Dr. Streubel sehr erfolgreich durchgeführt.