Comparative Genomic Hybridisation (CGH)

:: Defintion ::

Die CGH - Comparative Genomic Hybridisation (vergleichende genomische Hybridisierung) - ist eine Methode um genetische Veränderungen festzustellen. Sie erlaubt es numerische Unterschiede, Deletionen und Amplifikationen einzelner Chromosomen oder Chromosomenabschnitte festzustellen und ist daher als Screeningmethode geeignet.

Durch vergleichende Hybridisierung verschiedenfarbig markierter Genome auf eine Kontrollmetaphase können genomische Imbalancen zwischen zwei Genomen detektiert werden. Deletionen und Amplifikationen werden durch Unter- bzw. Überrepräsentation einer Hybridisierungssonde auf den betreffenden Chromosomenregionen sichtbar.

Die CGH bedient sich der in situ Hybridisierung mit Painting-Sonden, die ein spezifisches Chromosom in seiner Gesamtheit markieren, und ist eine Sonderform des reverse painting.
Hierbei wird die komplette genomische DNA als Hybridisierungssonde verwendet. Auf diese Weise können in einem einzigen Hybridisierungsvorgang alle Veränderungen innerhalb eines Genoms detektiert werden, die mit einem Zugewinn oder Verlust von DNA-Sequenzen einhergehen.

Einsatzgebiete

Die CGH wird eingesetzt bei Tumoren, wo sich nach der Kultivierung keine keine Metaphasen finden, oder bei Fällen, wo nur Zugewinne und Verluste interessant sind (für solide Tumoren).

Weiters ist der Einsatz der CGH für Paraffinpräparate interessant, wenn z.B. bei einem Elternpaar der Verdacht auf eine balanzierte Translokation besteht, aber alle Aborti der Frau bereits in Paraffin eingebettet sind. In diesen Fällen ist vom Paraffin nachträglich eine CGH möglich.

Index

:: Definition
:: Die Methode
:: Matrix-CGH
:: Quellenangabe


Begriffe

Genom

der haploide Chromosomensatz und die in ihm lokalisierten Gene, d.h. die Erbsubstanz eines Organismus

Genommutation

es entsteht eine numerische Aberration

Genmutation

betrifft ein Gen (z.B. zystische Fibrose, Muskeldystrophie)

Chromosomenmutation

es entsteht eine strukturelle Aberration

:: Die Methode

Aufbereitung der Proben-DNA

Bei der CGH wird die zu untersuchende genomische DNA-Probe in einer PCR mit einem grünen Fluorochrom markiert und mit einer zweiten, rot markierten Probe aus Normalgewebe zu gleichen Teilen gemischt. Beide DNAs werden und mit humaner Cot1-DNA gefällt, gereinigt, denaturiert und präannealt.

Die Cot1-DNA dient dabei der Absättigung hochrepetitiver DNA-Sequenzen im Bereich des Heterochromatins. Repetitive (sich wiederholende) DNA-Abschnitte, wie sie z.B. im Bereich der Chromosomenzentromeren vorkommen, haben eine unterschiedliche Hybridisierungskinetik im Vergleich zu einmalig vorkommenden Sequenzen und verursachen ohne Zugabe von Cot1-DNA ein sehr starkes Fluoreszenzsignal, welches die digitale Bildauswertung beeinträchtigen würde.

Hybridisierung

Ein Objektträger mit normalen Metaphasechromosomen wird ebenfalls denaturiert und mit der zuvor hergestellten DNA-Mischung hybridisiert.

Im Sinne einer Verdrängungsreaktion konkurrieren nun die markierten einzelsträngigen DNA-Fragmente beider Proben um freie Bindungsstellen an den komplementären DNA-Sequenzen der normalen Metaphasechromosomen und binden sich entsprechend ihrer Häufigkeit.

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Waschen und Färben

Nach der Hybridisierung werden ungebundene und unspezifisch gebundene DNA-Fragmente durch mehrere Waschschritte entfernt und die DNA mit zwei unterschiedlich fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen Biotin und Digoxigenin gefärbt. In den Metaphasechromosomen wird so eine Mischfarbe induziert, die je nach Zugewinn oder Verlust von DNA Sequenzen des zu untersuchenden Genoms in den betreffenden Chromosomenabschnitten nach grün bzw. rot abweicht.

Um die Chromosomen später einander zuordnen zu können wird der Metaphasen-Objekträger nach der Inkubation noch mit einem spezifischen dritten (blauen) Farbstoff für AT-reiche Sequenzen - DAPI (4,6-Diamidinophenylindol, DAPI) - gegengefärbt. Anhand des enstehenden Bildes ist die Identifizierung der Chromosomen durch ihr Bänderungsmuster möglich.

Visualisierung

Die Färberesultate der Zielchromosomen werden mit Hilfe eines Fluoreszenzmikoskops visualisiert und die Qualität der Hybridisierung anhand definierter Kriterien beurteilt. Dabei wird zunächst mit einer CCD-Kamera (charge-coupled device) die Metaphase nacheinander mit den für die verschiedenen Farben (rot: Normalgewebe-DNA, grün: Testgewebe-DNA, blau: DAPI-Gegenfärbung) unterschiedlichen Anregungsfilter aufgenommen.

Das für die blaue DAPI-Fluoreszenz spezifische Bild wird extrahiert, in ein Schwarzweißbild überführt, negativiert und kontrastverstärkt. Auf diese Art und Weise wird auf den Chromosomen ein G-Band-ähnliches Muster sichtbar, so daß sie eindeutig identifiziert werden können.
Desweiteren kann man hier auch den Verlust oder Zugewinn ganzer Chromosomen beurteilen. Die Chromosomen können computergestützt erkannt und zu einem Karyogramm ausgelegt werden.

Das zweite Bild zeigt eine rote Aufnahme, nämlich - unter entsprechendem Fluoreszenzfilter - die fluoreszierende Normal-DNA. Da man die Metaphasen aber mit voneinander unterschiedlich markierten DNAs hybridisiert hat, erfolgt noch eine grüne Aufnahme in der man die fluoresziernde Test-DNA sieht.

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der Vergleich

Am Computer erfolgt nun eine Überlagerung der zwei Fluorezensaufnahmen von Probe (grüne Aufnahme) und Normal-DNA (rote Aufnahme).
Nachdem man anhand des DAPI Bildes die Chromosomen am PC sortiert hat, kann der Rechner die Intensitäten der zwei Fluoreszenzen von Test- und Normal-DNA miteinander vergleichen.

CGH - Vergleich
    © www.mta-labor.info

Nach dem Angleichen der mittleren Fluoreszenzintensitäten von Grün- und Rot-Bild (Normalisierung) wird, beginnend vom Telomer des kurzen Armes entlang der medianen Achse eines jedes Chromosom, das Verhältnis der Intensitäten von Grün- und Rotfluoreszenz gemessen. Dabei wird die Messung an jedem Punkt der Achse über die gesamte Breite des Chromosoms integriert.

So wird für jedes Chromosom ein Verhältnisprofil der Fluoreszenzintensitäten (CGH-Ratioprofil) erstellt, an dem relative Zugewinne und Verluste von DNA-Sequenzen in den entsprechenden chromosomalen Abschnitten in Form einer Verschiebung des Ratioprofils abzulesen sind.

Ist nun z.B. die rote Fluoreszenz stärker als die grüne, weist das auf eine Deletion - einen Verlust eines Chromosomen Abschnittes - der Tumorzelle hin. Im umgekehrten Fall lässt es auf eine Amplifikation - einen Zugewinn eines chromosomalen Abschnittes - schliessen.

:: Schema - CGH und Matrix-CGH ::      :: Beispiel CGH ::

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:: Matrix-CGH

Matrix-CGHEin limitierender Faktor der CGH ist die Notwendigkeit, komplexe Strukturen auszuwerten, da die Hybridisierung auf Chromosomenpräparaten stattfindet. Mit der Entwicklung der DNA-Chip-Technologie kann eine Vielzahl von DNA-Sonden auf kleinstem Raum aufgebracht werden. Diese Technik ermöglicht es, das Auflösungsvermögen der chromosomalen CGH um ein Vielfaches zu erhöhen. Der Chip ersetzt dabei die Chromosomenpräparate.

Mit dieser Methode können ganze Genome in einem Hybridisierungsexperiment gleichzeitig auf Gewinn oder Verlust definierter DNA-Sequenzen (Sonden) untersucht werden. Die Hybridisierungsunterschiede werden statt auf den Chromosomen auf den "gespotteten" DNA-Sequenzen festgestellt.

Damit sind die Voraussetzungen für den Nachweis von Deletionen und Duplikationen am gesamten Genom geschaffen. Gemessen werden die quantitativen Unterschiede zur Test-DNA - so sind Veränderungen bis zu einer Auflösung von 0,5 Mb erkennbar. Derzeit sind 7600 Gene definiert.

Nachteil der Matrix-CGH: Mit dieser Technik sind keine balanzierten Translokationen nachweisbar. Zudem ist sie eine sehr kostspiele Methode.

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:: Quellenangabe

· CGH, Matrix-CGH, und cDNA-Array - Grundlagen und Möglichkeiten des diagnostischen Einsatzes in der Pathologie

Vortrag am 1. Zytogenetik Forum Österreich, 9. November 2002

Univ.Prof.Dr. Helmut Popper
Pathologisches Institut der Universität Graz
Labor für Molekulare Zytogenetik, Umwelt- und Atemtraktpathologie
Auenbruggerplatz 25
A- 8036 Graz