Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)

Definition

Die In situ Hybridisierung (IsH) ist eine Technik, die es ermöglicht, spezifische Nukleinsäuresequenzen in einem Zellpräparat sichtbar zu machen.

Bei der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) werden mittels fluoreszenz-markierter DNA-Sonden Gen- oder Chromosomenabnormalitäten entdeckt bzw. bestätigt, die über die klassische Zytogenetik (Chromosomenanalyse) nicht erfassbar sind.


Index

:: Definition
:: Gensonden
:: Metaphase FISH
:: Interphase FISH
:: Aneuploider Schnelltest
:: Quellenangabe
:: weiterführende Artikel

:: Gensonden

Als Hybridisierung bezeichnet man allgemein die Verschmelzung von zwei komplementären, also genau zueinander passenden, einsträngigen Nukleinsäuresträngen. Man muss also zum Nachweis einer bestimmten DNA- oder RNA-Sequenz eine entsprechende komplementäre Sequenz, die sogenannte Gensonde herstellen.

Herstellung von Gensonden

· Am einfachsten herstellbar sind einsträngige, kurzkettige DNA-Sonden. Diese sogenannten Oligonukleotide werden vor allem für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet, da sie auf Grund ihrer Kleinheit unter in situ Bedingungen die Spezifität der Bindung schwierig und wenig sensitiv ist.
(kurzkettig, als Primer für PCR)

· Als Sonden eignen sich weiters sowohl repetierte Sequenzen wie auch Sequenzen, die nur einmal pro haploidem Chromosomensatz vorkommen (single copy Sequenzen). Zu den meistgebrauchten repetierten Sequenzen gehören die (peri-)zentromerischen, chromosomspezifischen alpha- und einige beta-Satelliten. Sie eignen sich auch für Interphase-FISH und können als Indikator für die Anzahl des entsprechenden Chromosoms gebraucht werden.

Klonierte Gene bzw. DNA-Sequenzen werden erzeugt, indem definierte Gene bzw. Gensequenzen in lebende Mikroorganismen eingeschleust und vermehrt werden. Die am häuftigsten verwendeten Vektoren sind ringförmige, aus Viren stammende doppelsträngige DNA-Sequenzen, sogenannte Plasmide. Bei Plasmiden begegnet man wegen ihrer geringen Grösse allerdings oft gewissen Detektions-Problemen.
(Locus-spezifische Sonden)

Begriffserklärung:

repetiert = sich wiederholend
Plasmid = ziemlich kleines, extrachromosomales DNS-Fragment im Zytoplasma von Bakterienzellen. Plasmide können aus Bakterien isoliert werden und dienen in der Gentechnologie als Trägermoleküle zur Einschleusung von Fremd-Genen in Zellen.

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· Noch größere Gensonden können in Wirtszellen (Bakterien, Hefen) durch artifizielle Chromosomen (BAC’s, YAC’s) hergestellt werden.

· PCR-generierte Sonden: Mit der Polymerasekettenreaktion (PCR) kann man einfach in vitro große Mengen von DNA synthetisieren, limitierend für die Produktion von Sonden für die isH ist jedoch die Länge der mittels PCR synthetisierbaren DNA-Stränge.
(kurze bis mittellange Sonden)

Die Polymerasekettenreaktion (PCR) dient der Vervielfältigung definierter DNA-Abschnitte. Mit Hilfe geeigneter Oligonukleotid-Primerpaare, den Nukleotiden ATP, GTP, CTP, TTP, dem Enzym Polymerase und einem DNA-Template wird in einem Thermocycler in ca. 25-35 Reaktionszyklen der durch die Primerauswahl bestimmte Bereich der DNA millionenfach kopiert.

Je nach erforderlicher Sensitivität des Detektionsverfahrens werden in die PCR unmarkierte oder Fluoreszenzfarbstoff-markierte Substrate eingesetzt. Die Produkte der PCR sind Grundlage weitergehender Untersuchungen, beispielsweise der Fragmentanalyse nach Restriktionsverdau und der DNA-Sequenzierung oder dienen als Sonde für verschiedene Hybridisierungsverfahren.

· Isolierte Chromosomen: Ganze Chromosomen aus Metaphasenpräparaten oder Teile davon lassen sich durchflusszytometrisch bzw. durch zusätzliche Mikrodissektion isolieren und für die isH als Gensonden verwenden. Diese aufwändig herzustellenden Sonden werden zur FISH-Analyse von ganzen Chromosomen eingesetzt
(Painting-Sonden)

WCPEine besondere und viel gebrauchte Form von single copy Sequenz-Sonden sind die whole chromosome paints (WCP), die das ganze Chromosom markieren.
Es handelt sich um klonierte DNA-Fragmente von FACS-sortierten Chromosomen und neuerdings um direkt DOP-PCR-amplifizierte DNA von FACS-sortierten Chromosomen.

Erhältlich sind auch WCPs, die entweder für den kurzen (p) oder den langen (q) Arm eines Chromosoms spezifisch sind, sie eignen sich in der Regel nur für die Metaphasen-FISH.

Begriffserklärung:

DOP = degenerate oligonucleotide primer
FACS = fluorescence activated cell sorting

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:: Metaphase FISH

Indikationen

Die Fluoreszenz in situ Hybridisierung kann auf Metaphase Zellen (Chromosomen) angewendet werden, um:

· spezifische Mikrodeletionen zu erkennen, die in einem routinemäßigen Karyogramm nicht erkennbar sind
· Markerchromosomen zu identifizieren
· zusätzliches Chromosomenmaterial dem Ursprung zuzuordnen(z.B. Addition, Translokation)
· zu erkennen, ob bei einem Chromosom eine simple Deletion vorliegt oder es in ein komplexes Rearrangement involviert ist
· spezifische Rearrangements von Tumoren zu bestätigen

Metaphasen-FISHDie Anzahl der Mikrodeletionssyndrome, die mittels FISH identifiziert werden, steigen rapide an. Die Sensitivität des Tests ist höher als die der klassischen Zytogenetik, hängt aber von den einzelnen Syndromen ab.
Bei manchen Syndromen ist die Probe spezifisch für ein defektes Gen (z.B. Williams Syndrom), bei dem bei 96% aller Betroffenen eine Deletion in den Elastin-Genen vorzufinden ist.
Bei anderen Syndromen wie dem Prader Willi/Angelmann Syndrom ist die Etiologie der Syndrome verschiedenartig und Mikrodeletionen betreffen nur einen Teil der Fälle (60%).

Die Abbildung (© Seattle, WA Dynagene Cytogenetics Laboratory) zeigt zwei verschiedenfärbige Sonden auf Chromosom 22. Das grüne Signal ist eine interne Kontrolle und ist auf 22q13 lokalisiert, um die beiden 22er rasch zu identifizieren. Das rote Signal ist an der DiGeorge-Region 22q11.2 lokalisiert. Da beide roten Signale sichtbar sind, liegt in diesem Fall keine Mikrodeletion vor.

Mikrodeletionssyndrome, die mittels FISH diagnostiziert werden können

· Cri-du-Chat (Katzenschreisyndrom)
· Miller-Dieker-Syndrom
· Smith-Magenis Syndrom
· Steroid Sulfatase Deficiency
· Di George (CATCH 22) Syndrom
· Kallman Syndrom
· Williams Syndrom
· Wolf Hirschhorn Syndrom
· Prader Willi/Angelman Syndrom

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:: Interphase FISH

FISH wird auf Interphase Zellen angewendet, um:

· die Anzahl einzelner oder mehrerer Chromosomen zu ermitteln
· spezifische Chromosomenrearrangements zu bestätigen, die charakteristisch für einen bestimmten Tumor sind
· bei Tumoren, sie sehr langsam wachsen und keine Mitosen machen
· wenn sich im Präparat nur sehr wenig Zellen bzw. fast nur normale Zellen finden und man die Tumorzelle (Metaphase) nicht finden kann
· am Paraffinmaterial
· Schnelltest in der Pränataldiagnostik zur Vorinformation

Interphase-FISHDer Vorteil des Interphase FISH ist, dass er innerhalb von 24 Stunden durchgeführt werden kann, da keine Metaphasen dafür benötigt werden und daher die lange Zeitdauer der Kultivierung wegfällt.

Ein gutes Beispiel für Interphase FISH ist der Aneuploid Screen Test, der entwickelt wurde um Amnionzellen im Fruchtwasser zu untersuchen.

Wenn eine klinische Indikation vorliegt, wird das Fruchtwasser auf die häufigsten Trisomien untersucht. Die Proben-Kerne werden denaturiert und mit DNA-Sonden für die Chromosomen 13, 18, 21, X und Y hybridisiert.


Grenzen der Interphase-FISH in der Hämatopathologie (gegenüber PCR)

· hohe Reagenzienkosten
· Floureszenzeinrichtung nötig
· Auflösung geringer als bei PCR (Deletionen nur teilweise, Mutationen gar nicht nachweisbar)
· mit individuellen Gensonden nur einzelne genetische Fragestellungen beantwortbar – gezielt anhand Morphologie und Karyotyp Sonde auswählen
· Artefakte (Aneinanderlegungen der Sonden vs. echter Translokation)

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:: Aneuploider Schnelltest

Humangenetische Pränataldiagnostik

Vorgeburtliche Chromosomendiagnostik ist heute fester Bestandteil der Routinediagnostik, die insbesondere Frauen mit Risikoschwangerschaften angeboten werden.
Als Indikation für eine Amniocentese sind neben maternalem Altersrisiko besonders auffällige Ultraschallbefunde und Serummarker (Triple-Test, Combined-Test) von Bedeutung.

Chromosomen können während der Interphase des Zellzyklus nicht mit herkömmlichen zytogenetischen Methoden dargestellt werden, sondern nur während der Metaphase. Dieses verlässliche Standardverfahren setzt eine Kultivierung voraus.

Amniozentese und pränatale Gentests verursachen bei werdenden Eltern Streß. 86% der Frauen, an denen eine Amniozentese durchgeführt wurde, befürchten ernsthaft, dass der Test eine Abnormalität des Fetus nachweisen könnte.
Die zeitaufwendige Kultivierung der Amnionzellen, die sich auf über zwei Wochen erstrecken kann, und die damit verbundene Wartezeit bis zur Befundübermittlung stellt also eine erhebliche Belastung für die Schwangere dar. Deshalb suchen Pränatalmediziner und Humangenetiker nach Wegen aus diesem Dilemma.

Über die molekulare Zytogenetik mittels der Interphasen Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH) wird es möglich zu jedem Zeitpunkt des Zellzyklus eine Analyse durchzuführen.

Die FISH an unkultivierten Amnionzellen als neue Methode der molekularen Zytogenetik liefert innerhalb von 24 Stunden ein Ergebnis, bei die häufigsten chromosomalen Aberrationen mit hoher Sicherheit ausgeschlossen werden können.

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Schnelltest zur pränatalen Diagnostik

Die Interphasezellen enthaltenden Fruchtwasserproben werden mit zytogenetischen Standardmethoden auf Objektträgern fixiert.

Als ersten Schritt der FISH wird die präparierte Proben-DNA zur einsträngigen Form denaturiert. Chromosomenspezifische DNA-Sonden, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert worden sind, werden auf die unkultivierten Amnionzellen hybridisiert. Markiert werden Regionen auf den langen Armen der Chromosomen 13 und 21 sowie die Zentromerbereiche der Chromosomen 18, X und Y.

Danach kann die Anzahl der Signale ausgezählt werden. In einem Zellkern mit zwei homologen Chromosomen erwartet man 2 Fluoreszenzsignale, während man in einer Zelle mit einer Trisomie entsprechend 3 Signale findet.

Bei der klinischen Evaluation dieses Verfahrens hat sich jedoch gezeigt, dass auch bei Kontrollen in einigen Kernen 3 Signale vorhanden sind. Andererseits sind bei gesicherten Trisomiefällen in wenigen Zellen nur 2 Signale sichtbar. Daher kann sich eine Diagnose nicht auf einzelne Zellen stützen, eine Vielzahl von Zellkernen ist auszuwerten.

Erfahrungsgemäß sollte sich eine klinische Diagnostik auf mindestens 50 auswertbare Zellen stützen, in Zweifelsfällen muss diese Zahl auf bis zu 200 erhöht werden.

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Schwellenwerte für die Auswertung bei mindestens 50 Zellkernen

· Fall auffällig – über 60% aberrante Signale
· Fall unauffällig – über 90% unauffällige Signale
· Fall kontrollbedürftig (Mosaik) – 10-60% aberrante Signale

Möglichkeiten und Grenzen des aneuploiden Schnelltests

Die derzeitigen Empfehlungen hinsichtlich möglicher Konsequenzen bei abberanten FISH-Befunden gehen dahin, dass irreversible Eingriffe nur dann eingeleitet werden sollen, wenn gleichzeitig ein pathologischer sonografischer Befund vorliegt. Andernfalls sollte zur endgültigen Klärung das Ergebnis der konventionellen Chromosomenanalyse abgewartet werden.

Jedem aneuploidem Screening mit einem negativen Ergebniss muss dennoch eine klassische Routine-Zytogenetik folgen, um das Ergebnis zu bestätigen bzw. andere Aberrationen, die im FISH nicht entdeckt werden können (Translokationen, Markerchromosomen, Deletionen usw.) zu erkennen.

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:: Quellenangabe

Die Informationen zu dieser Seite entstammen teilweise dem

FISH-Workshop Zytogenetik
1. bis 2. April 2005
Wilhelminenspital, Pavillon 27, Zentrallabor

Kursorganisation und Leitung:
Univ. Doz. Dr. Berthold Streubel
Facharzt für Humangenetik
Inst. für Pathologie, AKH Wien
Währinger Gürtel 18-20, 1090 Wien

Fotos (wenn nicht anders angegeben): © der Bilder liegt bei der Firma Vysis

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:: weiterführende Artikel

:: FISH - verschiedene Techniken ::
:: FISH in der Praxis ::