FISH - verschiedene Techniken

Gewisse Chromosomenanomalien sind zwar mikroskopisch sichtbar, lassen sich jedoch über die klassische Zytogenetik auf Grund der Bänderung nicht genau definieren.

In anderen Fällen besteht der klinische Verdacht auf eine Chromosomenanomalie, ohne dass sie mikroskopisch nachweisbar ist (submikroskopische Aberrationen).
Beispiel hiefür sind die Mikrodeletions-Syndrome, wie z.B. DiGeorge-Syndrom, Prader-Willi/Angelman-Syndrom etc.

Eine in situ Hybridisierung (ISH) mit einer geeigneten Sonde kann dieses Problem lösen. Die Sonden sind entweder direkt mit einem Fluorophor wie z.B. FITC, Texas Rot etc. oder indirekt mit einem Hapten, meist Biotin oder Digoxigenin, markiert.
Nach der Hybridisierung der denaturierten Sonde und der denaturierten Chromosomen-DNA kann die spezifisch gebundene (komplementäre) Sonde im Fluoreszenzmikroskop, direkt oder indirekt - über Fluorophor-markiertes Avidin bzw. Anti-Dig-Antikörper - nachgewiesen werden (darum FISH).


Index

:: FISH
:: M-FISH
:: Telomer/Subtelomer-FISH
:: Reverse Painting
:: Fiber-FISH
:: Quantitative FISH
:: D-FISH
:: Cobra-FISH
:: Quellenangabe
:: weiterführende Artikel

:: Multi-Colour-FISH (M-FISH)

Mit der Technik der Multi-Colour-FISH (Vielfarben Fluoreszenz in situ Hybridisierung) wird durch den Einsatz mehrerer verschiedener Fluorochrome (Fluoreszenzfarbstoffe) jedes Chromosomenpaar spezifisch mit einem individuell zusammengesetzten Gemisch aus diesen verschiedenen Farbstoffen markiert.
Mit 24-Farben-FISH lassen sich alle menschlichen Chromosomen durch kombinatorische Markierung mit nur fünf Fluoreszenzfarben (Gold, Grün, Blau, Spectrum Orange, Far Red (Infrarot)) unterscheiden. Dadurch wird eine spezifische Färbung jedes der 24 menschlichen Chromosomen in einem Hybridisierungsexperiment möglich.

Für das menschliche Auge sind Unterschiede in den Emissionsspektren kaum mehr sichtbar, aber durch den Einsatz einer speziellen, hochempfindlichen CCD-Kamera (charge-coupled device) und geeigneter Computersoftware wird jedem Chromosompaar mit seinem charakteristischen Emissionsspektrum eine Farbe zugeordnet, so dass daraus ein Karyogramm mit unterschiedlich gefärbten Chromosomen resultiert.

Diese Methode eignet sich insbesondere zur Untersuchung von Translokationen, da sich die ausgetauschten Segmente zweier Chromosomen durch ihre unterschiedliche Fluoreszenzmarkierung leicht aufdecken lassen, die in einer herkömmlichen Bänderung nicht auffallen würden.

Zudem kann die Zusammensetzung von Markerchromosomen (= vom Bandentyp her nicht identifizierbare Chromosomen, enstanden durch den Zusammenbau von Chromosomenmaterial verschiedener Chromosomen unbekannter Herkunft) bestimmt werden.

Nachteil dieser Methode: Deletionen sind schwer, Inversionen (Austausch von Chromosomenmaterial innerhalb desselben Chromosoms) sind nicht erkennbar.

:: Beispiel M-FISH ::

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:: Telomer/Subtelomer-FISH

Eine weitere, zunehmend wichtigere Form von single copy Sequenzen sind die sogenannten Telomer-Sonden, welche für einen bestimmten Chromosomen-Arm (p /q) spezifisch sind und für den Nachweis von kryptischen terminalen Deletionen nützlich sind.

Telomer-FISHDie Subtelomerregionen eines jeden Chromosoms sind spezifische DNA-Sequenzen, die nahe den Enden der Chromosomen, den Telomeren, lokalisiert sind. Es sind genreiche Regionen, die wichtig für die Stabilität sind und die Chromosomenenden versiegeln. Ihre Größe liegt bei 3-20 Kilobasenpaare (kB).

Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsuntersuchungen (FISH-Analysen) haben gezeigt, dass bei Patienten mit unklarer mentaler Retardierung, auch in Verbindung mit Dysmorphiezeichen und einer Entwicklungsverzögerung, Chromosomenveränderungen in diesen Subtelomerregionen nachzuweisen sind. Dabei handelt es sich meist um kleinste Deletionen (Verluste) oder Translokationen (Austausche) dieser Bereiche. Diese Veränderungen werden auch als kryptische Deletionen oder kryptische Translokationen bezeichnet, da sie nicht mit den konventionellen Färbemethoden, jedoch aber durch eine FISH-Analyse mit spezifischen DNA-Sonden nachgewiesen werden können.

Bei dieser Färbung präsentieren sich die Telomere/Subtelomere als zwei Punkte am Chromosomenende. Im Falle einer Translokation liegen die Punkte auf einem anderen Chromosom.

Indikationen für ein Subtelomerscreening

· unauffälliges Karyogramm
· Familienanamnese
· Wachstumsretardierung
· mentale Retardierung
· Herzfehlbildung
· Omphalocele (organische Fehlbildungen)

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:: Reverse Painting (rev ish)

Eine elegante Variante des chromosome painting ist das Reverse Painting, bei welchem als Sonde die (amplifizierte) DNA des zu charakterisierenden Chromosoms gebraucht wird. Das betreffende Chromosom kann mittels FACS oder durch Mikrodissektion isoliert werden. Die daraus gewonnene Chromosomen-DNA wird DOP-PCR-amplifiziert, als FISH-Sonde markiert und mit normalen Metaphasen hybridisiert.

forward painting

Alle anderen FISH-Methoden sind forward painting Methoden (markiert ist hier die DNA-Sonde, die gegen ein bestimmtes Chromosom gerichtet ist). Dabei wird sichtbar, auf welchen Chromosomen sich die Sonde befindet. So werden Monosomien, Diploidien, Translokationen, Amplifikationsstrukturen (double minutes oder homogenously staining regions) oder Markerchromosomen sichtbar.

reverse painting

Reverse bedeutet, dass hier die Probe (das Patientenmaterial) markiert ist.

DNA-Sequenzen aus abnormen Chromosomen (also die Probe) werden auf vorgefertigte, normale Metaphasen hybridisiert. So kann z.B. ein isoliertes Markerchromosom analysiert werden, indem sich Signale auf jenen Chromosomen finden lassen, aus denen das Markerchromosom aufgebaut ist.

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:: Fiber-FISH

Es ist auch möglich mit gewissen Verfahren die Hybridisationssignale und die Chromosomen gleichzeitig zu identifizieren. Eine spezielle Anwendung stellt Fiber-FISH dar.

Die DNA-Sonden werden an lineare, nicht kondensierte, DNA-Stränge, die auf einem Objektträger erzeugt werden, hybridisiert, was zu einer sehr hohen Auflösung (im Bereich von wenigen kb bis maximal 500 kb) führt. Somit ermöglicht Fiber-FISH die lineare Anordnung von Loci, die sehr nahe beieinander liegen, und sich mit anderen Methoden nicht ordnen lassen.

Fiber-FISH ist eine Genkartierungsanalyse, Nachteil dieser Methode ist allerdings, dass die Zuordnung zu den Chromosom verloren geht.

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:: Quantitative FISH (Q-FISH)


Q-FISH dient zur Quantifizierung der spezifischen FISH-markierten DNA-Sequenzen in Interphase-Kernen und Metaphasen. Weiters können die Telomerlängen von Chromosomen quantifiziert werden, um das metastatische Potential von Tumoren zu ermitteln.

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:: Dual Fusion-FISH (D-FISH)

D-FISHBei der Doppelfusion handelt es sich um eine Mischung zweier Einzelsonden (grün und rot), die jeweils einen bestimmten Bruchpunkt überspannen (Dual color/dual fusion probe = Punktsonden (LSI)).

D-FISH dient zum Translokationsnachweis mittels bruchspezifischer Sonden auf Interphasenkernen und Metaphasen. Die Gensonden umspannen die typischen Bruchpunktregionen eines bekannten Translokationstyps, sodass bei einer stattgefundenen Translokation das Fusionssignal (beide Farbsignale eng beisammen) auf beiden translozierten Chromosomen zu finden ist, weil sich die markierten Regionen durch die Translokation aneinander angelagert haben.

Die beiden normalen Chromosomen weisen jeweils nur eine der beiden Farben auf.

Typische Beispiele:

· BCR/ABL der Translokation t(9;22)(q34;q11) der CML
· IGH/MYC der Translokation t(8;14)(q24;q32) des Burkitt-Lymphoms.

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:: Cobra-FISH

Cobra-FISH
© Kreatech Biotechnology

Cobra-FISH, Abkürzung für "combined binary ratio labeling-fluorescence in situ hybridization", ist eine Methode, bei der ähnlich der Vielfarben-FISH alle 24 Chromosomen angefärbt werden.

Für Cobra-FISH werden allerdings nur 4 anstelle von 5 Fluorophore benötigt, um durch kombinatorische Markierung alle Chromosomen anzufärben. Fügt man einen 5 Fluoreszenzfarbstoff hinzu, ist es sogar möglich 48 verschiedene Farben zu erlangen.

Die Farbidentifikation durch Cobra-FISH ist für alle p- und q-Arme durchführbar, wodurch mit dieser Technik neben interchromosomalen Rearrangements auch intrachromosomale Veränderungen (Inversionen) nachweisbar sind. Kombiniert mit der 24-Farben-FISH (M-FISH) ist es möglich perizentrische Inversionen und Isochromosomen genauso zu identifizieren wie komplexe Translokationen welche bei soliden Tumoren auftreten.

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:: Quellenangabe

· Grundlagen der Floureszenz in situ Hybridisierung

Vortrag am 1. Zytogenetik Forum Österreich, 9. November 2002

Univ.Prof.Dr. Erwin Petek
Institut für Medizinische Biologie und Humangenetik der Universität Graz
Humangenetisches Labor
Harrachgasse 21/8
A- 8010 Graz

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:: weiterführende Artikel

:: Floureszenz in situ Hybridisierung - Grundlagen ::
:: FISH in der Praxis ::