Peripheres Blut - Lymphozytenkultur

Zur Chromosomenanalyse beim Menschen ist grundsätzlich jedes Untersuchungsmaterial geeignet das Mitosen enthält oder bei dem man die Mitose anregen kann.

Peripheres Blut ist das am meisten verwendete Untersuchungsmaterial um den konstitutionellen (angeborenen) Karyotyp zu ermitteln. Lymphozyten eignen sich am besten zur Chromosomen-Darstellung, weil die Entnahme von venösem Blut einfach und die Mitoseausbeute bei der Kultivierung sehr gut ist.

Periphere Lymphozyten teilen sich im gesunden erwachsenen Menschen normalerweise aber nicht - sie müssen, um Mitosen zu bilden, stimuliert werden, z.B durch PHA (Phytohämagglutinin).

PHA wird aus Bohnen gewonnen und ist ein sogenanntes Mitogen. Das ist eine Substanz, die die Zellteilung induziert.

Achtung!
Die Kultivierung von Peripherem Blut wird in der Zytogenetik als Lymphozytenkultur bezeichnet. Der Begriff Blutkultur stammt aus dem Bereich der Mikrobiologie - hier werden Blutproben in speziellen Blutkulturflaschen auf aerobe/anaerobe Keime untersucht.


Index

:: Peripheres Blut
:: Indikationen
:: die Lymphozytenkultur
:: Lymphozyten
:: Mitogene
:: Abnahme
:: Kulturmethoden
:: Ansatz
:: Ernten
:: Präparation
:: Befundung
:: Quellenangabe

:: Indikationen

Pränataldiagnostik

· Ermittelung des konstitutionellen Karyotyps beider Elternteile eines ungeborenen Kindes, das in der Fruchtwasserpunktion oder Chorionzottenbiopsie einen auffälligen oder strukturell abnormen Karyotyp aufweist.
Hier soll ermittelt werden, ob die Eltern als Überträger der strukturellen Aberration in Frage kommen. Ist dies der Fall und der betreffende Elternteil symptomatisch unauffällig, kann die Auswirkung der Aberration auf das Kind abgeschätzt werden.
In de novo aufgetretenen, also nicht vererbten Fällen ist eine Abschätzung, ob das Kind genetisch unauffällig zur Welt kommt, schwer abzuschätzen, sofern die Aberration keinem bekannten Syndrom zugeordnet werden kann.

· Ermittelung des konstitutionellen Karyotyps beider Elternteile einer Tot- oder Fehlgeburt (Abortus) mit chromosomalen Abnormalitäten, um den Trägerstatus zu ermitteln.
Hier soll ermittelt werden, ob ein Elternteil eine symptomatisch unauffällige, balancierte Aberration aufweist. Solche balancierte Aberrationen, zumeist Translokationen, vermindern die Wahrscheinlichkeit auf eine problemlose Schwangerschaft um 50%, da die Aberration in unbalancierter Form weitergegeben wird. In weiteren 25% der Fälle wird dem Kind derselbe Trägerstatus vererbt. Nur in 25% der Fälle ist das Kind völlig gesund.
Das Wissen um einen solchen Trägerstatus ist für die Beratung bei unerfülltem Kinderwunsch und zahlreichen Fehlgeburten (habitueller Abort) unerlässlich.

Postnataldiagnostik

In der postnatalen zytogenetischen Diagnostik werden die Chromosomen bereits geborener Personen untersucht, wenn ihr klinisches Bild oder ihre Familienvorgeschichte dazu Anlass geben.

· Hilfe bei der Diagnose von chromosomalen Bruchsyndromen wie z.B. Fanconi's Anämie

· Ermittlung des konstitutionellen Karyotyps zur Abklärung von Minderwuchs bei Mädchen und von Hochwuchs bei Knaben, um den Verdacht auf ein Turner- bzw. Klinefelter-Syndrom auszuschließen bzw. zu bestätigen

· Vergleich des lymphozytären Karyotyps mit denen anderer Gewebetypen (Haut, AC oder CVS) zur Bestätigung von strukturellen und numerischen Aberrationen oder Mosaiken

· Diagnose/Ausschluß von klassischen durch Chromosomenstörung bedingten Syndromen (typisches klinisches Bild oder eine Kombination von geistiger und statomotorischer Retardierung, Dysmorphien, Dystrophie, körperlichen Stigmata)

Tumorgenetik

· Ermittelung des konstitutionellen Karyotyps bei Patienten mit hämatologischen Erkrankungen oder soliden Tumoren zum Vergleich mit chromosomalen Veränderungen in den neoplastischen Zellen

Bei einigen hämatologischen Erkrankungen ist es seit langem Tradition, dass Blut zur zytogenetischen Untersuchung herangezogen wird, schon alleine deshalb, weil es problemlos zu gewinnen ist.
Jedoch müssen im Blut auch genügend Zellen sein, die in der Lage sind sich zu teilen.

Bei akuten Leukämien ist es immer von Vorteil, wenn man neben Knochenmark auch das periphere Blut kultiviert. So gibt es einige Leukämieformen, bei denen man in Lymphozytenkulturen oft mehr und bessere Mitosen findet, als in den Kulturen aus dem Knochenmark.
Bei akuten lymphatischen Leukämien ist es sogar sehr wichtig auch das Blut zu untersuchen. Da im Knochenmark bei einer ALL meist noch genügend teilungsfähige normale myeloische Zellen vorhanden sind, kann so ein fälschlich normaler Befund die Folge sein.

Auch bei "trockenen" Punktionen, wo es bedingt durch die Erkrankung nicht möglich ist Knochenmark zu aspirieren (z.B. sehr dicht gepacktes Mark oder Markfibrose), oder auch bei Patienten, die eine Punktion verweigern, sind Blutkulturen oft die einzige Möglichkeit doch einen zytogenetischen Befund zu erstellen.

Ebenso kann bei dem Verdacht auf eine chronische myeloische Leukämie zuerst eine Lymphozytenkultur angesetzt und ausgewertet werden, bevor man eine Knochenmarkspunktion durchführt. Gerade bei dieser Patientengruppe gibt es oft Studienprotokolle zu beachten, die wegen des großen Aufwands bei der Probenversendung nur bei entsprechendem zytogenetischen Befund sinnvoll sind. Durch die Lymphozytenkultur kann man diesen Patienten eine zweite Knochenmarkspunktion ersparen.

:: Ich danke Fr. Helga Grüner vom Genetischen Labor des Hanuschkrankenhauses für diese sehr interessanten Informationen bezüglich "Lymphozytenkulturen in der Tumorgenetik".

Weiters

· Materialbeschaffung für Interphase- und Metaphase-FISH

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:: die Lymphozytenkultur

Die meisten Abnormalitäten bei hämatologischen Erkrankungen werden aus Zellkulturen von Knochenmarkspunktaten oder unstimuliertem Peripherem Blut ermittelt.

Unstimulierte Lymphozytenkulturen sind geeignet für die Ermittlung des erworbenen Karyotyps bei sich spontan teilenden Zellen hämatologischer Erkrankungen, und zum Ernten von neonatalen Blutproben (umbilicales Nabelschnurblut und periumbilicale Blutproben).

Manche hämatologischen Erkrankungen wie z.B. CLL wachsen besser in stimulierten Lymphozytenkulturen mit den verschiedensten Mitogenen wie z.B. Pokeweed Mitogen, Concanavalin A oder PHA.

Vorteile von Lymphozytenkulturen

· nicht invasive Abnahme
· relativ billige Kulturmethode
· kurze Kulturdauer
· hoch-qualitative Metaphasechromosomen im Überfluss
· Kulturwiederholung aus der Originalprobe auch nach 4-6 Tagen noch möglich
· postmortem bis zu 48 Stunden später kultivierbar

Einschränkungen

· Fälle, in denen Mosaike vorkommen, werden bei Lymphozytenkulturen nicht immer erkannt, weil manche Zelllinien über die Dauer des Wachstums verloren gehen
· Fälle, in denen sich die Aberrationen im Peripheren Blut gar nicht zeigen (z.B. Pallister-Killian Syndrom, das nur in Fibroblasten festgestellt werden kann)

Blut stammt vom mesodermalen Keimblatt ab und bringt keine Zelllinien hervor, die von Ektoderm und Endoderm abstammen.

Mesoderm - Muskelgewebe, Lymphgefäßsystem, Urogenitaltrakt
Endoderm - Respirationstrakt, Blase, Vagina, Urethra (woher auch Amniozyten stammen)
Ektoderm - Haut, Nervensystem

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:: Lymphozyten

Peripheres Blut entsteht durch die Hämatopoese im Knochenmark, während die Lymphknoten zusätzlich Lymphozyten und Monozyten beisteuren.

Bestandteile

Peripheres Blut enthält Erythrozyten, Leukozyten, Thrombozyten, Serumproteine, Lipide, Fibrinogen, Glucose, Wasser, Gase, Salze, Antikörper, Hormone, Urease und Kreatinin.

Wenn Blut gerinnt, nennt man die übrigbleibende Flüssigkeit Serum.
Fügt man vor dem Gerinnungsvorgang ein Antikoagulanz wie Heparin hinzu, und das Blut setzt sich nach einiger Zeit ab bzw. wird zentrifugiert, nennt man die klare Flüssigkeit oberhalb des Pellets Plasma.

Zwischen den roten Zellen am Röhrchenboden und dem Plasma befindet sich ein hellgrauer/weißlicher Ring, der sogenannt buffy-coat, der die weißen Zellen enthält.

20-40% der weißen Zellen im buffy-coat sind Lymphozyten.
Davon sind 55-75% T-Zellen (thymus-abhängige Zellen für die zelluläre Immunität) und 15-30% B-Zellen(bursa-abhängige Zellen, verantwortlich für die humorale Immunität und Antikörperproduktion).

T- und B-Zellen können im Lichtmikroskop nicht unterschieden werden, allerdings verhalten sie sich unterschiedlich bei Zugabe eines Mitogens. Im Beisein von Mitogenen machen kleine Lymphozyten einen Prozess durch, der als Transformation bekannt ist. Bei diesem Prozess vergrößern sich die Zellen und die Anfärbbarkeit des Zellkerns wechselt. Diese transformierten Zellen sind geeignet für die Zellteilung.

Manche Mitogene (PHA oder Concanavalin A) stimulieren primär die T-Zellpopulation, während andere (Pokeweed Mitogen oder Eppstein Barr Virus) primär die B-Zellen beeinflussen.
Manche Erkrankungen (Lymphome, Di-George Syndrom) reagieren besser auf ein B-Zell-Mitogen.
Manchmal ist auch ein Cocktail von B-und T-Zellmitogenen sinnvoll, z.B bei Tierchromosomen.

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:: Mitogene

Anfang des Jahrhunderts wurde entdeckt, dass ein Protein-Rohextrakt aus der Jakobsbohne (Canavalia ensiformis) humane Erythrozyten agglutiniert. Das gereinigte Protein wurde als Concanavalin A (Con A) bezeichnet.

In der Folge wurden weitere Agglutinine aus Pflanzen isoliert, die Erythrozyten zum Teil blutgruppenspezifisch agglutinieren - daher die Bezeichnung Phyto-Hämagglutinine.

Für Phyto-Hämagglutinine gibt es mehrere Bindungsstellen in der Zellmembran. So gibt es eine Affinität von Con A zu Glucose, während PHA komplexere Oligosaccharide erkennt.

Lymphozyten zeigen unter dem Einfluss eines Hämagglutinins durch die Bindung des Mitogen-Moleküls an die Zellmembran eine Veränderung der Membraneigenschaften. Eine erhöhte Durchlässigkeit der Zellmembran beschleunigt den Informationsaustausch zwischen der Zelle und der Umgebung. Schon 10-15 Stunden nach erfolgtem PHA-Kontakt kommt es zu einer gesteigerten Aufnahme von Molekülen in die Zelle, wodurch die Makromolekül-Synthese in den Lymphozyten angekurbelt wird. Es werden sowohl die Synthese von Proteinen und Nukleinsäuren stimuliert, als auch die von Botenstoffen wie Lymphokine (z.B. Interleukin-2).

Phytohämagglutinin

Das häufigst verwendete Mitogen ist PHA (Phytohämagglutinin).

Wenn T-Lymphozyten diesem Pflanzenantigen (Extrakt der roten Nierenbohne) ausgesetzt werden, reagieren sie darauf wie sie es auch innerhalb des Körpers auf eine artfremde Substanz tun würden. Die reifen T-Zellen entdifferenzieren zu einer T-lymphoblastischen Zelle. In dieser Form ist die T-Zelle in der Lage, Mitosen zu bilden, um DNA aufzubauen.

Während der ersten 24 Stunden nach Zugabe von PHA machen die T-Zellen die oben beschriebene Transformation durch. Währt die Kulturdauer jedoch länger, durchleben sie mehrere Zellteilungen.
Die höchste Mitosenaktivität wird nach 60-70 Stunden erreicht. Dies ist der ideale Zeitpunkt für das Ernten.

Neugeborene haben noch viele zirkulierende Blasten im Blut. Aus diesem Grund kann man bei Neugeborenen schon nach 24 Stunden die ersten Mitosen sehen, nach 48 Stunden erhöht sich die Anzahl der Mitosen deutlich, die ideale Wachstumsdauer allerdings beträgt 72 Stunden.

Bei Erwachsenen, vor allem bei schwangeren Frauen, sind zwar 72 Stunden-Kulturen befriedigend, besser sind allerdings 96 Stunden-Kulturen. Die meisten Mitosen, die man nach 48 Stunden findet, repräsentieren Zellen, die lediglich eine einzige Zellteilung durchgemacht haben. Die meisten 72-Stunden-Kulturen haben 2 Zellteilungen abgeschlossen.

Die ideale Kulturdauer von Nabelschnurblut liegt bei 48 Stunden.

Lymphozytenkulturen degenerieren nach vier oder fünf Generationen und können nicht weiter stimuliert werden.

Phytohämagglutinin im Handel

Die früheren Bezeichnungen zielen auf den jeweiligen Reinigungsgrad ab.
· PHA ist erhältlich als PHA-M, eine Substanz die außer dem reinen Protein auch ein Mucoprotein enthält.
· PHA-P bezeichnet das reine Protein, von dem die Hälfte der Polysaccharide entfernt wurden.

Da PHA-P eine vorwiegend Erythrozyten agglutinierende Eigenschaft hat, wird es mit den neuen Bezeichnungen PHA-E genannt.
PHA-M heißt wegen der Lymphozyten stimulierenden Eigenschaften nun PHA-L.

Achtung: PHA ist ein großes Molekül und passt nicht durch einen 0,2 um-Filter. Immer erst nach einer Filtration zusetzen.

Zu viel PHA wirkt toxisch, zu wenig PHA resultiert in schwacher Mitosenbildung.

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:: Abnahme

Das Antikoagulanz der Wahl ist Sodium Heparin.

Andere Antikoagulanzien wie Lithium Heparin, EDTA und Citrat können die Zellkultur von Lymphozyten stören. Falsch abgenommene Proben sollten sofort mit Sodium Heparin versetzt und anschließend zwei- bis dreimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen werden.

Antikoagulanzien wie EDTA und Citrat sind Chelatbildner, das bedeutet dass sie Kalzium-Ionen binden, um eine Gerinnung zu verhindern. Solange jedoch das Kalzium im Medium präsent ist, kann die Zellkultur verklumpen.

Anders die Wirkung von Heparin: Es wirkt als Antithrombin und bewirkt eine irreversible Thrombinbindung. Dadurch kann die Umwandlung von Fibrinogen in Fibrin nicht mehr erfolgen, die Zellkultur kann auf deshalb nicht mehr verklumpen (unabhängig davon, ob Kalzium vorhanden ist).

· Lyophilisiertes Heparin ohne Konservierungsmittel ist beim Kauf vorzuziehen. Es wird mit sterilem NaCl aufgelöst (wobei jede gewünschte Konzentration einstellbar ist).

· Flüssiges Heparin enthält üblicherweise Alkohol als bakteriostatischen Wirkstoff, kann aber erfolgreich verwendet werden.

Achtung: Heparin, das Phenol enthält, ist sehr toxisch und sollte auf keinen Fall verwendet werden!

Die optimale Heparin-Konzentration liegt bei 10-25 IU/ml Blut.

Abhilfe bei geronnenen Proben

Geronnene Blutproben können unter Umständen gerettet werden, indem das Gerinnsel mit einer Schere aufgeschnitten wird, um die Zellen vom Fibrinklumpen zu lösen. Die dissoziierten Zellen danach in heparinisiertes Zellkulturmedium einbringen.

Aufbewahrung der Probe

Wird die Probe nicht am selben Tag in Kultur gebracht, bei Raumtemperatur lagern.
Die Blutproben können noch 4 bis 6 Tage nach Abnahme kultiviert werden. Winzige Proben (z.B. Nabelschnurblut) am besten in sehr kleinen Gefäßen aufbewahren, da sie in großen Gefäßen leicht austrocknen.

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:: Kulturmethoden

Es gibt zwei Kulturmethoden: die Makrotechnik und die Mikrotechnik

Makrotechnik

· Vollblutansatz - 0,4 bis 1,0 ml Blut werden in 5 bis 10 ml Medium eingebracht

Bei Neugeborenen und bei Patienten mit einem hohen Hämatokrit sollte eine geringere Blutmenge in Kultur gebracht werden, da zuviele Erythrozyten pro Milliliter Blut die Kultur beeinträchtigen können.

pro 10 ml Kulturmedium:

· 0,8 ml Vollblut bei Erwachsenen
· 0,6 ml Vollblut bei Neugeborenen und Kindern
· 1 ml Vollblut bei schwangeren Frauen

Mikrotechnik

· Ansatz des buffy-coats

Zur Auftrennung der Blutbestandteile wird das Periphere Blut bei 800 rpm für 5-10 min zentrifugiert. Der buffy-coat befindet sich zwischen den roten Zellen am Röhrchenboden und dem Plasma als hellgrauer/weißlicher Ring.

Um die Auftrennung zu erleichtern, können die mononukleären Zellen (Lymphozyten und Monozyten) mit Trennlösungen wie Ficoll®, Percoll oder Lymphoprep isoliert werden. Dazu wird 1:1 mit NaCl verdünntes Vollblut über die Trennlösung geschichtet und zentrifugiert. Die mononukleären Zellen bilden danach eine weiße Grenzschicht zwischen Plasma und Ficoll®-Lösung, die Erythrozyten und Granulozyten befinden sich im Sediment.

Der buffy coat wird nach der Zentrifugation vorsichtig mit einer Pasteurpipette abgehoben, mit NaCl verdünnt und 2 bis 3 mal gewaschen. Vom gewaschenen Pellet werden 0,5 bis 1,0 ml in 10 ml Kulturmedium eingebracht.

Für eine optimale Lymphozytenkultur sollten 1 bis 2 mal 10hoch6 Leukozyten pro Milliliter Medium angesetzt werden.

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:: Ansatz

Kulturgefäße

Kunststoffgefäße, die behandelt wurden um eine gute Zelladhäsion zu gewährleisten (für Langzeitkulturen) sind für die Kurzzeitkultur der Lymphozytenkultur ungeeignet.

Verwendet werden können Flasks, Zellkulturflaschen, Schrägtuben und Chamberslides. Bei Kunststoffgefäßen ist Polypropylen zu bevorzugen (anstelle von Polystyrol), wenn im selben Gefäß auch die Fixierung stattfindet (durch das Methanol-Essigsäure-Gemisch entsteht in Verbindung mit Kunststoffen Methylacetat - diesem Effekt wiedersteht Polypropylen).

Kulturmedium

Am häufigsten werden verwendet:

· Eagle's MEM
· DMEM
· MEM Alpha Modifikation
· Medium 199
· Ham's F10
· RPMI1640 und
· McCOY's 5A

Es gibt auch sehr gute Komplettmedien auf dem Markt, denen vor Gebrauch nur noch PHA zugesetzt werden muss.

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Zusätze / Medium

Stellt man sein Medium selbst her, gibt es einige wichtige Zusätze, die auf keinen Fall fehlen dürfen:
· Kälberserum
· Antibiotikum
· Heparin
· Mitogen

Kälberserum ist instabil und sollte bis zur Verwendung bei -20°C aufbewahrt werden. Komplettmedien oder selbstgemachte Medien, die Kälberserum enthalten, auf keinen Fall länger als 10 Tage im Kühlschrank lagern.

Kälberserum:
Serum pro Charge austesten (auf Zellwachstum)
das Serum sollte auf Mycoplasmen getestet sein, sonst muss man es bei Hitze inaktivieren

Antibiotikum:
es verhindert das Wachstum von Mikroorganismen

Heparin:
wichtig bei Vollblutansatz, vor allem wenn die Probe wegen falscher Abnahme (falsches Probenröhrchen) gewaschen werden musste
verhindert die Gerinnung

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Wachstumszusätze

Wachstumszusätze werden vor allem für serumreduziertes und serumfreies Kulturmedium benötigt.
· Epidermal Growth Faktor (EGF)
· Fibroblast Growth Faktor (FGF)
· T-Cell Growth Faktor
· Interleukin-2 (IL-2)

Temperatur

Idealerweise 36 bis 37,5°C

Geringere Temperaturen verzögern das Wachstum, Temperaturen über 40°C führen zum Zelltod.

Die Wachstumzeit einer Kultur ist abhängig von der Temperatur des Brutschrank - Kulturen bei 37,5°C wachsen schneller als solche bei 36°C.

Ansatz

Pro Patient werden zwei Zellkulturen angelegt.
· Für die Bestimmung des konstitutionellen Karyotyps werden zwei stimulierte Kulturen angelegt: 
  bei Neugeborenen je 5 ml Medium 0,3 ml Blut ansetzen, Wachstumsdauer 72 h
  bei Erwachsenen 0,4-0,5 ml Blut ansetzen, Wachstumsdauer 72-96 h
· Für die Bestimmung eines erworbenen Karyotyps ist es sinnvoll, sowohl eine stimulierte als auch eine unstimulierte Kultur anzulegen.

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:: Ernten

Synchronisierung

Chemische Zusätze wie Ethidiumbromid oder Actinomycin D führen zu längeren, gestreckteren Chromsomen. Aber auch eine kurze Einwirkzeit von Colcemid® bewirkt eine Verlängerung der Chromosomen. Je kürzer Colcemid® einwirkt, umso länger werden die Chromsomen, allerdings verringert sich dabei die Anzahl der Metaphasen deutlich.

Um viele Mitosen zum Zeitpunkt des Erntens zu erreichen, kann eine Synchronisierung durchgeführt werden. Zusätze wie Metatrexat, Leucovorin, Thymidin oder Deoxycytidin werden der Zellkultur vor dem Ernten zugesetzt. Die Einwirkzeit von Colcemid® kann nach der Synchronisierung auf 10 - 20 Minuten reduziert werden.

Wird ein hoher Mitoseindex benötigt (z.B. um Mosaike zu finden) kann die Einwirkzeit von Colcemid® aber auch erhöht werden - für Prophase/Prometaphase-Studien sollte Colcemid® jedoch maximal 30 Minuten einwirken.

Hypotone Lösung

üblicherweise 0.075 M KCl (warm oder bei Raumtemperatur 10 bis 30 Minuten)

Folgende Methode ist vor allem wichtig bei Vollblutkulturen:

Die erste Reaktion der Zellen auf die hypotone Lösung ist die Lyse der meisten Erythrozyten. Die resultierende Hämolyse verändert die Hypotonizität des Überstandes, was eine zweite hypotone Behandlung notwendig macht um einen optimalen Effekt zu erreichen.

Fixierung

Die Fixierung wird eingeleitet indem man ein paar Tropfen des Methanol-Essigsäure-Gemisches im Verhältnis 3:1 der hypotonen Lösung beigibt.

Die Fixierung kann aber auch erst nach Abzentrifugieren der hypotonen Lösung beginnen. In diesem Fall das Pellet nur langsam mit jeweils einigen Tropfen des Fixatives mischen, um Klumpenbildung zu vermeiden.

Mehrere Fixierschritte sind nötig, um die Kultur von Erythozyten-Hüllen und Methämoglobin (brauner Überstand) zu befreien, die bei der Lyse der roten Blutkörperchen durch das Fixativ entstehen. Ein klarer Überstand ist wichtig für eine optimale Objektträgerpräparation.

Aufheben der Suspension

Nach der Fixierung und der Einstellung der Zelldichte kann das Pellet für mögliche weitere Prozeduren (FISH, Spezialfärbungen) aufgehoben werden.

Idealerweise wird die Suspension in einem kleinen Behältnis aufbewahrt, das bis oben hin vollgefüllt wird um möglichst wenig Luft in dem Behältnis zu haben. Danach im Tiefkühlschrank lagern.
Aufgetropfte Objektträger für FISH in einer Box frisch (nicht altern) einfrieren.

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:: Präparation

Weiterführende Informationen zu diesem Themenbereich finden Sie in der Rubrik "Praxis"

:: Auftropfen - Erstellen von Präparaten ::

:: Altern und Färben ::

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:: Befundung

· Fragestellung: konstitutioneller (angeborener) Karyotyp
Pro Patient werden 20 Metaphasen im Mikroskop ausgezählt. Die direkte Analyse im Mikroskop hat die höchste Aussagekraft. Zur Dokumentation sind allerdings Fotos unumgänglich. Dazu wird von 3 bis 5 Metaphasen jeweils ein Karyogramm erstellt.

Im Falle einer Trisomie 21, 13 oder 18 wird auf 30 Mitosen ausgezählt, 10 davon karyotypisiert.
Im Falle eines Klinefelter Syndrom-Mosaikes zählen wir 50 (in seltenen Fällen auch 100) Metaphasen aus.
Im Falle eines Turner Syndrom-Mosaikes zählen wir 50 Metaphasen aus.
Bei jedem Turner Syndrom wird ein Screening auf Y-Anteile mittels PCR angeschlossen.

· Fragestellung: Chromosomenaberration (ohne klaren Hinweis), Mikrodeletionssyndrome (Cri du Chat Syndrom, Wolf Hirschhorn Syndrom, Prader Willi / Angelman Syndrom, Smith Magenis Syndrom, Williams Beuren Syndrom, Di George Syndrom)
Pro Patient werden 10 Metaphasen im Mikroskop ausgezählt und karyotypisiert. Bei diesen Fragestellungen wird weiterführend eine FISH durchgeführt, um die Mikrodeletionen mittels Gensonden zu bestätigen.

· Fragestellung: Infertilitätsabklärung bei Männern
Pro Patient werden 10 Mitosen im Mikroskop ausgezählt und karyotypisiert. Wird mindestens einmal ein Mosaik mit einer numerischen Aberration gefunden, wird auf 50 Metaphasen ausgezählt. Weiters wird ein Y-PCR-Screeningauf Deletionen am Langen Arm des Y-Chromosoms durchgeführt.

· Fragestellung: Mehrfachabortus / unerfüllter Kinderwunsch
Pro Patient werden 10 Mitosen im Mikroskop ausgezählt und karyotypisiert. Wird mindestens einmal ein Mosaik mit einer numerischen Aberration gefunden, wird auf 50 Metaphasen ausgezählt.

:: Ich danke Frau Gabriela Kronberger vom Institut für klinische Genetik in Salzburg für diese Aufstellung.

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:: Quellenangabe

Wenn nicht anders gekennzeichnet:

· The AGT Cytogenetics Laboratory Manual

Autor: M.J. Barch, T. Knutsen, J.L. Spurbeck
Jahr: 3. Auflage
Verlag: Lippincott-Raven
ISBN 0-397-51651-7