Nachweis Prader-Willi und Angelman-Syndrom

:: Phänotyp ::

Prader-Willi-(PWS) und Angelman-Syndrom (AS) sind klinisch unterschiedliche Erkrankungen mit signifikanten Entwicklungsstörungen.

Prader-Willi-Syndrom (PWS)

• Atmungs- und Ernährungsprobleme im Säuglingsalter
• angeborene Muskelhypotonie
• gestörtes Appetitverhalten
• massives Übergewicht
• Kleinwuchs, kleine Hände und Füße
• moderate mentale Retardierung
• Hypogonadismus

Angelman-Syndrom (AS)

• schwere mentale Retardierung
• kein Spracherwerb
• kleines Mittelgesicht, großer Mund, Progenie, weiter Zahnabstand
• Lachanfälle ("happy")
• ruckartige Extremitätenbewegungen ("puppet")
• muskuläre Hypotonie
• Anfälle

Index

:: Phänotyp
:: Genomic Imprinting
:: genetische Mechanismen
:: Diagnostik
:: Methylierungstest
:: Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung
:: Mikrosatellitenanalyse
:: Anwendung der Methoden
:: Quellenangabe
:: weiterführende Artikel

:: Genomic Imprinting

Ursprünglich ging man davon aus, dass homologe Chromosomen unabhängig von der elterlichen Herkunft gleichermaßen exprimiert werden. Aus Experimenten mit Mäusen hat man jedoch festgestellt, dass die Aktivität mancher Gene von der elternspezifischen Prägung, dem so genannten "parent of origin", abhängig ist.

Anhand der beiden Krankheitsbilder Prader-Willi-Syndrom (PWS) und Angelman-Syndrom (AS) wurde von der Arbeitsgruppe um Rob Nicholls 1989 beim Menschen erstmalig nachgewiesen, dass es Gene gibt, die in Abhängigkeit von ihrer elterlichen Herkunft wirken (elternspezifische Prägung, auch genomic imprinting genannt).

aktive GeneDiese unterschiedliche Wirksamkeit ist auf die keimbahnspezifische Aktvierung bzw. Inaktivierung dieser Gene zurückzuführen.
Infolge der Prägung unterscheiden sich die väterliche und mütterliche Kopie dieses Bereichs in ihrer Chromatinstruktur, dem Methylierungsgrad (Gehalt an 5-Methylcytosin) der DNA und der Genexpression. Solch ein für die jeweils paternal oder maternal geerbten DNA-Abschnitte charakteristisches Methylierungsmuster kann mit molekulargenetischen Techniken untersucht werden.

PWS und AS werden durch den Funktionsverlust von Genen hervorgerufen, die nur auf dem einem der beiden elterlichen Chromosomen aktiv sind. Der Funktionsverlust kann hervorgerufen werden durch eine Deletion auf dem betreffenden elterlichen Chromosom 15 (Region 15q11.2q13), einer uniparentalen Disomie (beide Chromosomen 15 von nur einem Elternteil vererbt) oder eines Imprintingfehlers (mütterliche Prägung des väterlichen Chromosoms oder umgekehrt).

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:: genetische Mechanismen

siehe dazu auch :: Theorie / Prader-Willi-Syndrom (PWS) / Angelman-Syndrom (AS) ::

Das Prader-Willi-Syndrom entsteht durch den Funktionsverlust von Genen auf dem langen Arm des paternalen Chromosoms 15 (15q11-q13). Die Gene unterliegen einer elternspezifischen Prägung (Imprinting), in deren Folge nur die Genkopien auf dem väterlichen Chromosom aktiv sind und die Genkopien auf dem mütterlichen Chromosom 15 dagegen inaktiv sind.

Der Funktionsverlust der väterlichen Genkopien in der Region 15q11.1-q13 und damit ein vollständiger Funktionsverlust dieser Gene kann drei Ursachen haben:

• eine Mikrodeletion des väterlichen Chromosoms mit einer Größe von weniger als 3 kb (70-75% der Fälle)
• das komplette Fehlen des väterlichen Chromosoms 15 bei gleichzeitiger Anwesenheit zweier mütterlicher Chromosomen (maternale uniparentale Disomie, ca. 25-30% der Fälle)
• eine mütterliche Prägung des väterlichen Chromosoms - das Gen ist inaktiv statt aktiv (Fehler im Imprining Center (IC), ca. 1% der Fälle).

Genetik PWS

Das Angelman-Syndrom entsteht durch den gleichen Genverlust wie beim Prader-Willi-Syndrom, allerdings auf dem langen Arm des maternalen Chromosom 15. Ein Funktionsverlust der mütterlichen Gene in der Region 15q11.2-q13 (und damit ein vollständiger Funktionsverlust) entsteht durch

• eine Mikrodeletion im von der Mutter geerbten Chromosom (70-75% der Fälle)
• durch eine paternale uniparentale Disomie (ca. 2%)
• etwa 2-5% der Patienten haben einen Imprintingfehler
• bei den verbleibenden 20-25% der Patienten lässt sich derzeit keine Mutation nachweisen
• bei einigen Patienten sind Mutationen im UBE3A-Gen beschrieben

Genetik AS

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:: Diagnostik

Zur Untersuchung wird EDTA-Blut oder DNA von Mutter, Vater und Kind/Fetus benötigt.

Die zytogenetische Untersuchung war lange Zeit die einzige Labormethode zur Diagnose des PWS und AS, daher war es besonders wichtig möglichst lange Chromosomen zu erhalten, d.h. ein hohes Auflösungsvermögen zu erreichen, um die Mikrodeletion in der klassischen Zytogenetik erfassen zu können.

1981 beschrieb Ledbetter erstmals eine Mikrodeletion als Ursache für PWS
1989 beschrieb Pembrey erstmals eine Mikrodeletion als Ursache für AS

Eine konventionelle Chromosomenanalyse (klassische Zytogenetik) sollte zum Ausschluss chromosomaler Veränderungen sowie als Voraussetzung für die Durchführung einer FISH auf jeden Fall durchgeführt werden. Eine Deletion von 15q11.1-q13 kann jedoch nur mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) erkannt werden, eine maternale uniparentale Disomie durch Kopplungs-/Mikrosatellitenanalysen.

Deletion 15q11.1-q13
Bild: Deletion der Region 15q11.1-q13 des mütterlichen Chromosoms 15 (links)

Die Diagnostik der klinisch gestellten Verdachtsdiagnose erfolgt zunächst mit einer Methylierungssensitive PCR (MS-PCR), die eine Aussage über das Vorliegen eines PWS bzw. AS zulässt. Die molekulare Ursache wird in einer anschließenden FISH-Analytik zum Ausschluss einer Deletion bzw. einer Mikrosatellitenuntersuchung des Chromosom 15 zum Ausschluss einer Deletion bzw. uniparentalen Disomie (UPD) ermittelt.

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:: Methylierungstest

Sie gilt als Goldstandard für die Bestätigung der klinischen Diagnose bei PWS und AS. Die MS-PCR ist eine äußerst sensitive Methode zum Nachweis des Methylierungsstatus in bestimmten Genregionen. Die epigenetische Prägung ist vom Methylierungsgrad abhängig und bleibt über die Zellteilung hinweg erhalten. Bei geprägten Genen sind maternale und paternale Allele unterschiedlich methyliert.

Die Methylierung betrifft vorwiegend Cytosinbausteine in CpG-reichen Regionen an regulatorischen Sequenzen vor inaktiven Genen. Cytosine vor aktiven Genen sind nicht methyliert. Die Prägung von den in der 15q11-q13 Region lokalisierten Genen wird von einem zweiteiligen Imprinting-Center gesteuert. Es liegt upstream von SNRPN (small nuclear ribonucleoproteinassociated polypeptid N) bzw. überlappt mit SNRPN. SNRPN und mehrere andere Gene werden nur vom väterlichen Chromosom 15 exprimiert. Der 5’ Bereich dieser Gene ist auf dem väterlichen Chromosom unmethyliert und auf dem mütterliche methyliert. Das UBE3A-Gen wird im Gehirn nur vom mütterlichen unmethylierten Chromosom 15 exprimiert.

Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Methode zur in-vitro-Amplifikation einer bestimmten DNA-Sequenz mit Hilfe von DNA-Polymerasen

Die Amplifikation erfolgt durch zyklisch wiederholte Anlagerung von einzelsträngigen, synthetisch hergestellten DNA-Fragmenten (Primer) an denaturierte einzelsträngige genomische DNA und Verlängerung dieser Fragmente durch eine DNA-Polymerase. Diejenigen DNA-Sequenzen, an die sich die Primer anlagern, müssen bekannt sein.

Durchführung

• Denaturierung bei 95°C
• Hybridisierung bei 40 – 65°C (Spezifische Primer)
• Synthese bei 72°C (DNA-Polymerase, Nukleotide)

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Methylierungsensitiven PCR

Bei der Methylierungsensitiven PCR (MS-PCR) wird die differentielle Methylierung untersucht und man unterscheidet durch chemische Modifikation der DNA (Sulfitierung) zwischen methylierter und nicht methylierter DNA. Hierfür eignet sich DNA aus EDTA-Blut, Chorionzotten und Amnionzellen des Probanden.

Das Verfahren basiert auf der Bisulfit-Modifikation der genomischen DNA der Patienten und anschließender Allel-spezifischer PCR. Durch die Bisulfit-Behandlung tritt eine Sequenzänderung aller nicht-methylierter Cytosinbasen ein (Cytosin wird in Uracil umgewandelt), während 5-Methyl-Cytosin-Basen unverändert bleiben. Diese Sequenzänderung ist nur bei nicht methylierter DNA möglich, da die methylierte DNA geschützt ist.

Aufgrund dieser chemischen Veränderung entstehen Sequenzen, die sich von der ursprünglichen Sequenz unterschieden. Die modifizierte DNA wird dann mittels PCR amplifiziert. Die bei der PCR verwendeten Primer-Sets sind so kreiert, dass sie methylierte DNA von nicht-methlyierter DNA unterscheiden und nur an modifizierte nicht-methylierte DNA binden. Weiters binden sie an verschiedenen Stellen in der kritischen Region, was zur Entstehung ungleich langer PCR-Produkte führt, die getrennt voneinander detektierbar sind. Aufgrund dessen kann man die maternale von der paternalen Bande differentieren. Pro Analyse werden jeweils ein P (paternales) und ein M (matenrales) Primer Set eingesetzt.

• Aktive Gene – nicht methyliert - Sequenzänderung (PCR-Produkt entsteht)
• Inaktive Gene (oder deletiert) – methyliert (geschützt) bzw. fehlend - keine Sequenzänderung (man erhält kein PCR-Produkt)

Durch die Verwendung entsprechender Primer kann die Sequenzänderung nachgewiesen werden und man erhält verschieden lange Fragmente für das paternale (100 bp) und maternale (174 bp) Produkt.


Diese Methode ist hervorragend zum Screenen bei Verdacht auf PWS bzw. AS geeignet und liefert rasch Ergebnisse. Da damit zwar Deletionen, UPD und sämtliche Imprintingfehler nachweisbar sind, deren Unterscheidung jedoch nicht möglich ist, wird zur Aufklärung des zugrunde liegenden Mechanismus die Mikrosatellitenmethode herangezogen.

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:: Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH)

Während die Chromosomenanalyse einen Gesamtüberblick über alle im Lichtmikroskop erkennbaren Chromosomenaberrationen gibt, können mit Hilfe der Fluoreszenz In situ Hybridisierung (FISH) auch submikroskopische Veränderungen nachgewiesen werden. Ein Vorteil der FISH-Methode ist, dass die Analyse auch an Interphasekernen durchgeführt werden kann.

Single Copy Sonden – bestehen aus DNA-Fragmenten, die nur ein einziges Mal im Genom vorkommen – werden zur Markierung einzelner Genorte verwendet.

Sonde PWS/ASFür PWS ist neben einer uniparentalen Disomie zu einem wesentlich größeren Anteil eine Mikrodeletion des Locus SNRPN, für AS die Loci D15S10 und UBE3A innerhalb der Region 15q11.2q13 verantwortlich. Diese Deletion ist mit einer Metaphase-FISH gut nachweisbar, ein normales Ergebnis schließt eine uniparentale Ursache für PWS oder AS jedoch nicht aus.

Hierbei wird eine Sonde auf das Präparat aufgebracht, dessen Fluoreszenzsignale im Mikroskop sichtbar gemacht werden - rot für den Bereich 15q11-13 und grün als Kontrolle im Telomerbereich. 15qter

Die uniparentale Disomie ist mittels Metaphase-FISH-Analyse nicht nachweisbar.


FISH normalFISH Deletion

Bild links: normale Chromosomen 15 (ish 15q11-q13(SNRPN x 2))
Bild rechts: Fehlen eines roten Signals, Deletion von 15p11-13 (ish del(15)(q11-q13)(SNRPN-))

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Kombination FISH und MS-PCR

Deletion
– MS-PCR pathologisch
– FISH pathologisch

UPD / Fehler im IC
– MS-PCR pathologisch
– FISH normal

Bei einer Deletion, einer UPD oder einem Imprintingfehler fehlt entweder die mütterliche oder die väterliche Bande. Bestätigung von Deletion bzw. UPD / Fehler im IC durch eine Mikrosatellitenuntersuchung.

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:: Mikrosatellitenanalyse

Bereits seit 1985 spielen DNA-Typisierungsysteme eine zunehmend wichtiger werdende Rolle hinsichtlich humangenetischer Aspekte, wobei Alec Jeffreys und seine Mitarbeiter entscheidende Vorarbeit geleistet haben. Sie berichteten als erstes von einer Technik, die sie als "DNA-Fingerprinting" bezeichneten.

In der Zwischenzeit hat man eine Reihe von Methoden entwickelt, die eine Genotypisierung zulassen, unter anderem vorangetrieben durch das ehrgeizige Vorhaben das menschliche Genom ehest möglich vollständig zu sequenzieren, was im Humangenomprojekt erfolgreich umgesetzt wurde. Die Methode der Mikrosatellitenuntersuchung ist inzwischen ein gewichtiger Bestandteil für Vererbungsanalysen im medizinischen Bereich.

Mikrosatelliten-Polymorphismen beruhen auf kurzen sich wiederholenden (repetitiven) Basenabfolgen, die direkt hintereinander vorkommen. Die wiederholte DNA-Sequenzen können Di-(Tandemsequenzen), Tri- und Tetranukleotide sein. Durch die unterschiedlichen Wiederholungszahlen sind diese repetitiven Sequenzen hoch polymorph und von Mensch zu Mensch verschieden. Sie werden, auch wenn sie selbst nicht codierend sind, ebenso wie codierende Gene nach den Mendelschen Gesetzen vererbt. Diese repetitiven Tandemsequenzen werden als DNA-Marker eingesetzt, zu deren Vorteil die gleichmäßige Verteilung im Genom, der ausgeprägte Polymorphismus und der einfache Nachweis mit Hilfe von PCR-Verfahren zählen.

LociFür die Mikrosatellitenanalyse wird DNA des Probanden und der Eltern benötigt. Es werden Loci innerhalb des typischen Deletionsbereichs („interne Marker“) und Loci außerhalb des typischen Deletionsbereichs („externe Marker“) untersucht.

Bei Nachweis eines abnormalen Methylierungsmusters sollte mindestens ein interner Marker und ein externer Marker informativ sein. Fehlt bei internen Markern ein elterliches Allel, während bei externen Markern Allele beider Eltern nachweisbar sind, handelt es sich um eine Deletion.

Fehlt bei internen und bei externen Markern ein elterliches Allel, handelt es sich um eine UPD.

Bei einer UPD können isodisome und heterodisome Bereiche vorkommen. Sind bei internen und externen Markern Allele beider Eltern nachweisbar, handelt es sich bei Vorliegen eines abnormalen Methylierungsmusters um einen Imprintingfehler.

Durchführung

• PCR
• Sequenzgel
• Silberfärbung
• Befundung

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Auswertung / Beispiele

Reihenfolgte der Bandenmuster: Mutter - Kind - Vater

 

normale Vererbungnormale biparentale Vererbung

Das mittlere, kindliche Muster zeigt jeweils eine Übereinstimmung mit dem linken, mütterlichen sowie dem rechten, väterlichen Chromosom-15-Bereich. Was beweist, dass das Kind sowohl ein mütterliches als auch ein väterliches Chromosom 15 besitzt.

maternale UPDmaternale UPD

grün, links - gesamtes Chromosom 15 - es sind nur mütterliche Chromosomen 15 zu sehen
grün, rechts - interne Marker - es fehlt im kindlichen Bandenmuster die väterlich übereinstimmende Bande
rot - die Kontrolle (externe Marker) zeigt deutlich, dass auch hier ein väterliches Allel fehlt (es fehlt somit ein väterlich vererbtes Chromosom 15)

paternale Deletionpaternale Deletion

grün, rechts - interne Marker - es fehlt im kindlichen Bandenmuster die väterlich übereinstimmende Bande
rot - die Kontrolle (externe Marker) zeigt deutlich, dass Allele beider Eltern nachweisbar sind

:: Bild / Leitlinien für die Anwendung der Methoden ::

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:: Anwendung von molekularen und zytogenetischen Methoden

Prader Willi Syndrom

  FISH MS-PCR Mikrosatelliten
Deletion Deletion Pathologisch Paternale Deletion
UPD Normal Pathologisch UPDmat
Imprint Defekt Normal Pathologisch Normale biparentale Vererbung

Angelman Syndrom

  FISH MS-PCR Mikrosatelliten
Deletion Deletion Pathologisch Maternale Deletion
UPD Normal Pathologisch UPDpat
Imprint Defekt Normal Pathologisch Normale biparentale Vererbung
UBE3A-Mutation Normal Normal Normal

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:: Quellenangabe

· Diagnosemöglichkeiten bei bei Prader Prader Willi / Angelman Angelman Syndrom

Vortrag am 3. Zytogenetik Forum Österreich, 12. November 2005

Gabriela Kronberger, Biomedizinische Analytikerin
Klinische Genetik
LKA Salzburg
Müllner Hauptstraße 48
A- 5020 Salzburg

© der Bilder und des Textes liegen bei der Autorin

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:: weiterführende Artikel

:: Mikrodeletionen ::
:: Plazentamosaik und Uniparentale Disomie ::
:: FISH in der Praxis ::

Weiterführender Link

· Leitlinien für die Diagnostik bei Prader-Willi-Syndrom und Angelman-Syndrom