Pränataldiagnostik - Genetik

:: Amniocentese ::

Bei der Amniocentese (Abk. AC) werden kindliche Zellen gewonnen. Diese können von der Haut, aus dem Urogenital- und Respirationstrakt des Kindes sowie von der Amnionhülle stammen und schwimmen frei im Fruchtwasser.

Die Amniocentese wird ambulant und ohne Betäubung durchgeführt. Zuerst wird die Hautstelle zwischen Nabel und Symphyse desinfiziert und der Real-time- Ultraschallapplikator an einer geeigneten Stelle plaziert. Im Anschluß daran wird die Punktionsnadel unter ständiger Ultraschallkontrolle in die Amnionhöhle vorgeschoben und Fruchtwasser mit einer Spritze abgesaugt.

Um mütterliche Kontamination weitgehend zu vermeiden, werden die ersten Milliliter Fruchtwasser verworfen. Die ideale Menge zur Kultivierung liegt bei 20 ml, mindestens jedoch 5 ml.

Index

:: Amniocentese
:: Chorionzottenbiopsie
:: Transport
:: Kulturmethoden
:: Kulturansatz
:: Kulturbedingungen
:: Wachstum
:: Primär- oder Subkultur
:: Wachstumsprobleme
:: Altern der Präparate
:: Befundung
:: Quellenangabe

:: Chorionzottenbiopsie

Bei der Chorionzottenbiopsie (chorionic villus sampling - CVS) wird Gewebe mit darin enthaltenen kindlichen Zellen entnommen. Die Biopsie wird zwischen der 10. und 12. SSW durchgeführt.
Wichtig ist es, zwischen mütterlichen und kindlichen Zotten zu unterscheiden. Werden irrtümlich mütterliche Zotten entnommen, führt dies zu einem falschen Ergebnis der zytogenetischen Untersuchung.
Der Eingriff wird ambulant und üblicherweise ohne Betäubung vorgenommen. Die Punktion ist mit einer Blutabnahme zu vergleichen, die zwar unangenehm, aber nicht schmerzhaft ist.

Aufgrund der Direktpräparation der CVS kann der Befund innerhalb von 3 Tagen fertiggestellt werden. Da die Zellen nicht durch Kultivierung zur Teilung gebracht werden, muss man mit den Mitosen Vorlieb nehmen, die in den Zotten vorhanden sind - und damit eine wesentlich schlechtere Chromosomenqualität. Strukturelle Aberrationen können nur bedingt festgestellt werden.

Aus diesem Grund wird die Direktpräparation der CVS durch eine Langzeitkultur abgesichert.

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:: Transport

Die Amniocentese wird nativ in der Abnahmespritze ans Humangenetische Labor übersandt. Der Transport sollte im Idealfall nicht länger als 30 Minuten dauern, maximal jedoch 24 Stunden.
Der Ansatz der Amnionzellkultur sollte am selben oder am nächsten Tag der Abnahme erfolgen.

Die Chorionzottenbiospie wird in einem Transportmedium, üblicherweise RPMI-1640 versetzt mit Heparin, übersandt.

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:: Kulturmethoden

Folgende Möglichkeiten gibt es, eine Amnionzellkultur bzw. Chorionzottenlangzeitkultur anzulegen:
· Chamber-Slides
· in situ Kultivierung - Slide Flasks (auch als "whole-kulture method" bezeichnet)
· in situ Kultivierung in einer Petrischale mit einem Deckglas
· Gewebekulturflasche (Flask)

· offenes System
· geschlossenes System

Petrischalen und Chamber-Slides werden generell im offenen System kultiviert, bei Slide-Flasks und Gewebekulturschalen ist sowohl ein offenes als auch ein geschlossenes System möglich.

Geschlossenes System:
· besserer Schutz vor Kontamination
· das Flask muss vorher richtig begast werden - dadurch ergeben sich mehr Probleme als beim offenem System, da Amnionzellen am besten bei wenig (2,5-5%) Sauerstoff wachsen

Offenes System:
· durch Deckel mit Belüftungsnocken ist ein Gasaustausch mit der Umgebung möglich - ein Brutschrank mit den idealen Kultivierungsbedingungen dient als Inkubator
· Flasks im offenen System - bei Schraubkappen ohne CO2-durchlässigen Filtern muss man den Verschluss manuell offen halten, indem man ihn nicht komplett zuschraubt
· kultiviert man Fruchtwasser in Flasks, verwendet man zur Unterstützung ein Bikarbonat-Puffer-System. Das Kulturmedium enthält einen organischen Puffer und stabilisiert dadurch den pH-Wert im CO2-Milieu.

In der Literatur wird weder die in situ-Kultivierung noch die Flask-Methode speziell empfohlen, in der Regel wachsen in situ-Kulturen schneller.

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:: Kulturansatz

Es werden pro Patient 2 Kulturen und routinemäßig untersucht. Pro Ansatz sollte man niemals weniger als 5 ml Fruchtwasser pro Kultur verwenden - ideal sind 10 ml.
Generell kann gesagt werden: je mehr Fruchtwasser pro Ansatz, umso kürzer ist die Wachstumsdauer.

Die Chorionzotten werden für die Direktpräparation über Nacht in ein nährstoffreiches Kulturmedium überführt, um die Mitosenbildung anzuregen.

· Kulturmedium:

für Amnionzellkulturen gibt es auf dem Markt spezielle AC-Fertigmedien (streng geheime Spezialrezepturen), die großteils als Komplettmedium geliefert werden

Chang Medium®
Chang Medium® ist ein Fertigmedium und wird üblicherweise für Primärkulturen von Aminozyten und das Zellwachstum von Chorionzottenbiopsien verwendet, kann aber auch für die Kulturen von Knochenmarkzellen verwendet werden.
Das Medium wurde sowohl für den Gebrauch in 5% CO2-Atmosphäre als auch für das geschlossene System entwickelt.
· speziell für Amniozyten und Chorionzotten

AminoGrow plus
AmnioGrow Medium ist ein Fertigmedium und wird für das Zellwachstum von Amionzellen und Chorionzotten verwendet.
AmnioGrow plus enthält FKS (fötales Kälberserum), Wachstumsfaktoren, Insulin, L-Glutamin und Gentamycin.
· für Amniozyten und Chorionzotten

· Zusätze:

Stellt man sein Medium selbst her, gibt es einige wichtige Zusätze, die auf keinen Fall fehlen dürfen:
· Kälberserum
· L-Glutamin
· Antibiotikum

Kälberserum und Glutamin sind instabil und sollten bis zur Verwendung bei -20°C aufbewahrt werden. Komplettmedien oder selbstgemachte Medien, die Kälberserum enthalten, auf keinen Fall länger als 10 Tage im Kühlschrank lagern.

Kälberserum:
Serum pro Charge austesten (auf Zellwachstum)
das Serum sollte auf Mycoplasmen getestet sein, sonst muss man es bei Hitze inaktivieren

L-Glutamin:
aliquotieren und einfrieren, erst vor Gebrauch zufügen

Antibiotikum:
wird generell in primären Kulturen verwendet
es verhindert das Wachstum von Mikroorganismen nach dem Erstellen von Subkulturen
· Penicillin-Streptomycin - Penicillin 50-100 U/ml, Streptomycin 50-100 ug/ml

Generell kann gesagt werden, dass eine gute Kulturtechnik unter sterilen Bedingungen eine Kontamination weitgehend verhindert. Wenn dennoch eine Kontamination auftritt, ist sie vermutlich gegen das Antibiotikum resistent. In so einem Fall so rasch wie möglich ernten, weil sich die Zellen mit der Zeit vom Untergrund zu lösen beginnen.

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:: Kulturbedingungen

Die optimale Wachstumstemperatur liegt bei 37-37,5°C.
Einen konstanten pH-Wert erreicht man durch ein 5%iges CO2-Milieu in Luft oder Stickstoff (reiner Sauerstoff wirkt toxisch, sobald der den Wert in der Luft übersteigt).
Die Luftfeuchtigkeit der Umgebung für das offene System liegt bei 96%.

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:: Wachstum

Die erste Wachstumkontrolle im inversen Mikroskop ist abhängig von der Methode - zu häufige Überprüfung der Kulturen verlangsamt das Wachstum, weil man sie dabei aus den idealen Wachstumsbedingungen "reißt" und der kühleren Raumtemperatur aussetzt.
Überprüft man zu selten, kann man eine eventuelle Kontamination übersehen, oder die Kulturen wachsen zu dicht.

Die Flaskmethode erfordert eine erste Kontrolle nach etwa 7 Tagen, ist nach 8-10 Tagen noch nichts gewachsen, muss die Punktion wiederholt werden. Die Geschwindigkeit, mit der Kulturen anwachsen, ist abhängig von der Anzahl an vitalen kindlichen Zellen im Fruchtwasser. Diese variieren nach der Höhe der Schwangerschaftswoche (SSW) - Fruchtwasser aus der 14.SSW enthält zumeist viel weniger Zellen als Fruchtwasser aus der 18.SSW, und wächst daher langsamer.

· Wechsel des Mediums (Füttern):

Normalerweise werden Flask-Kulturen 3 bis 4 Tage nach dem Ansatz das allererste Mal gefüttert (halber Medienwechsel). Danach wird alle 2 bis 3 Tage gefüttert.

Bei in situ-Kulturen und Chamber-Slides wird das Medium erst später gewechselt, dafür wird etwas früher Medium zugefüttert.

Ist die Kultur mit Blut oder Schmutz (Debris) verunreinigt, wird ein kompletter Medienwechsel durchgeführt und die Kultur vor Zugabe des neuen Mediums mit PBS-Puffer gespült.

· Wachstumsdauer:

Slide Flasks-Methode - Amniocentese: Die Primärkulturen wachsen in der Regel 9 - 14 Tage, dann werden sie in situ geerntet.
Slide Flasks-Methode - Langzeitkultur CVS: Die Kulturen wachsen in der Regel 11 - 16 Tage (inklusive Erstellung der Subkultur), dann werden sie ebenfalls in situ geerntet.
Direktpräparation - Chorionzotten: Da eine Kultivierung nicht erforderlich ist, kann der Befund am zweiten Tag nach der Entnahme fertiggestellt werden.

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:: Primär- oder Subkultur

Bei der mikroskopischen Kontrolle achtet man darauf, ob gerundete Zellen (Mitosen) vorhanden sind. Amnionzellkulturen werden, unabhängig von der Kulturmethode, in situ geerntet, d.h. dass die Zellen direkt auf dem Objektträger wachsen und dort verbleiben - es wird keine Suspension erstellt.

Bei Monolayer-Kulturen setzen sich die kindlichen Zellen auf dem Slide oder Deckglas verteilt fest und bilden von den betreffenden Stellen aus Klone. Aus jeder einzelnen Zelle wächst eine ganze Kolonie an Zellen, die derselben Zelllinie angehören.
Bei der Wachstumskontrolle wird die Anzahl der Kolonien begutachtet, die Wachstumsparameter der einzelnen Kolonien eingeschätzt. Kleinere und dünnere Klone haben mehr aktive Zellen, zumeist an der Peripherie, wo das Wachstum noch spärlich ist. Das ist auch der Bereich, wo Metaphasen nach dem Ernten die Möglichkeit haben, sich gut zu spreiten.
Daher sollte man bis zum Ernten nicht zu lange warten - wird die Kultur zu dicht, wachsen die einzelnen Klone ineinander. Man kann dann weder die Zelllinien zuordnen (erschwert die Diagnose eines eventuell vorhandenen Mosaiks), noch haben die Chromosomen genug Platz um sich auszubreiten.

Angestrebt wird, Primärkulturen zum Ernten zu bringen. Hier liegen die Klone in ihrer ursprünglichen Wachstumsordnung vor - entstanden aus Zellen, die von Ursprungsgewebe stammen. Am besten ist ein Mediumwechsel direkt am Tag vor dem Ernten - dies löst eine Teilungswelle der Zellen aus und bringt reichlich Mitosen mit sich.

Bei Subkulturen hingegen werden die Zellen "durcheinander gewirbelt" - Kulturartefakte (Pseudomosaike) können nur noch schwer bestimmt werden. Tritt eine chromosomale Aberration in nur einem Klon der Primärkultur auf, ist dies als Kulturartefakt zu werten und zu vernachlässigen. Durch die Erstellung einer Subkultur werden die Zellen dieses Einzelklons über den gesamten Slide verstreut und stellen sich wie ein Mosaik dar.

Subkulturen werden durch das sogenannte Trypsinieren erstellt. Dazu wird ein Enzym verwendet (0,05% EDTA-Trypsin). Primäre Amnionzellkulturen (Monolayer) sind leicht zu suspendieren - wegen der leichten Lösung der Zellen durch Trypsin ist EDTA eigentlich unnötig. Schlecht wachsende Primärkulturen können allerdings schwer zu überführen sein.
Wichtig ist, Trypsin nicht zu lange auf die Zellen einwirken zu lassen, da sie sonst Schaden nehmen und schlecht anwachsen. 20-30 Sekunden ist bei Flask-Kulturen ausreichend, um die Zellen vom Untergrund zu lösen.

Subkulturen werden erstellt:
· wenn die Primärkultur nicht über den Slide verteilt wächst, sondern nur einzelne dichte Klone hervorbringt
· wenn die Kultur zu dicht wird und eine optimale Spreitung der Metaphasen unwahrscheinlich ist
· wenn sich trotz Zellwachstum kaum Mitosen bilden
· von CVS-Langzeitkulturen werden immer Subkulturen erstellt, weil sie von den Gewebspartikeln (Zotten) ausgehend sehr dicht wachsen und ohnehin keine Klone (aus Einzelzellen), sondern Kolonien bilden

Subkulturen werden 24 - 48 Stunden nach dem Trypsinieren geerntet. Die Primärkultur wächst in der Regel ebenso schnell nach - wird jedoch wie eine Subkultur behandelt.

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:: Wachstumsprobleme

Schlechtes Wachstum ist von mehreren Faktoren abhängig:

· Zellzahl (Zellen pro Milliliter) - dies hängt unter anderem von der SSW (Schwangerschaftswoche) ab
· Menge an Fruchtwasser (je weniger, umso langsamer bzw. schlechter das Wachstum)
· Bedingungen bei Entnahme (sterile Bedingungen)
· Bedingungen beim Transport (je schneller der Ansatz erfolgen kann, umso besser)

7 Tage nach dem Kulturansatz sollten zumindest ein bis zwei Kolonien vorhanden sein. Manche Kulturen brauchen 8-10 Tage, bis sie richtig auf "Touren" kommen.

Schmutzige Kulturen (Debris):

Schmutz lagert sich zwischen den Zellen am Slide ab und kann das Wachstum behindern. Er kann stark reduziert werden, indem man nach der ersten Wachstumskontrolle einen kompletten Medienwechsel durchführt und die Kultur mit PBS-Puffer spült.

Blutige Kulturen:

Ist die Fruchtwasserprobe bereits augenscheinlich blutig, kann die Menge an Erythrozyten das Wachstum erheblich stören.
Mehrere Versuche in unserem Labor haben gezeigt, dass es wenig Sinn macht zu warten, bis man im Mikroskop erstes Zellwachstum sichtet - die Kultur wächst deutlich schneller, wenn das Blut so rasch wie möglich entfernt wird.

Folgende Vorgehensweise hat sich bewährt:
· ganzer Medienwechsel beim 1. Mal Füttern
· ganzer Medienwechsel inklusive Spülen mit PBS-Puffer beim 2. Mal Füttern

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:: Altern der Präparate

Direkt nach dem Ernten:

Die Minuten nach dem Ernten entscheiden, ob sich die Chromosomen optimal spreiten. Selbst bei Raumtemperatur sollte man bedenken, dass die Luftfeuchtigkeit im Raum das Spreiten und die Qualität des Bändens beeinflusst. Daher sollten die Objektträger in einer Kammer mit idealen Bedingungen (40% Luftfeuchtigkeit, 20°C Temperatur) zwischengelagert werden.

Bewährt hat sich hier eine Trockenkammer für Tabak, die Luftfeuchtigkeit wird mittels Silikatgel-Kugeln (saugen überschüssige Feuchtigkeit auf) reguliert.

Die Trocknungsdauer der Präparate beinflusst der richtige Anstellwinkel - je steiler umso schneller kann das Fixativ abfließen. Trocknen die Präparate zu schnell, haben die Metaphasen keine Zeit sich zu spreiten. Trocknen die Präparate zu langsam, driften die Metaphasen auseinander.

anschließende Trocknungszeit:

G-Banding mit Trypsin auf frischen Präparaten bringt keine gute Bänderung der Chromosomen. Doch in der Pränataldiagnostik ist es nicht möglich, die Objektträger 3 Tage lang bei Raumtemperatur altern zu lassen. Jeder Tag ist kostbar.

Eine verbesserte Bänderung erreicht man, indem man die Glasobjektträger über Nacht bei 60°C im Ofen (Brutschrank) oder 1 1/2 bis 2 Stunden bei 70°C trocknen lässt.
Ideal ist eine Trocknungszeit von 20 Minuten bis 1 Stunde bei 90°C im Ofen.

Kunststoffslides (von Slide Flasks) hingegen sind für die Trypsin-Bänderung ungeeignet. Für diese Präparate hat sich die GAG-Bänderung mit 2xSSC bewährt.

Hierfür hat sich bei der Direktkultur der Chorionzottenbiopsie gezeigt, dass 2 Stunden Trocknungszeit bei 70°C ausreichen, die Kunststoffslides von AC und CVS-Langzeitkultur sollten 3 bis 4 Stunden in der klimatisierten Trockenkammer verbleiben.
Anschließend werden die Präparate über Nacht bei 60°C in 2xSSC gestellt und danach direkt mit einem gepufferten Giemsafarbstoff gefärbt.

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:: Befundung

· Auszählen:

Bei der Flask-Kultur sind das absolute Minimum pro Patient 15 Metaphasen - ideal sind 10 Mitosen pro Kulturansatz, möglichst eine Zelle pro Klon.

in situ-Kultur - jeweils 1 Zelle von 15 Kolonien auf zwei Deckgläsern

Chorionzotten Direktpräparation - 15 Metaphasen sind ausreichend, sofern das Ergebnis durch eine Langzeitkultur mit weiteren 10 bis 15 Metaphasen bestätigt wird

· Analysieren:

Die direkte Analyse im Mikroskop hat die höchste Aussagekraft. Zur Dokumentation sind allerdings Fotos unumgänglich.
Dazu werden 2 bis 3 Ausdrucke per Hand analysiert, von 2 weiteren wird jeweils ein Karyogramm erstellt.

· mütterliche Kontamination:

Schon bei der Wachstumskontrolle der Kulturen kann man MCC (maternal cell contamination) unter Umständen erkennen - sie zeigt sich durch fibroblastenähnliches Wachstum in der Kultur aus einem Stück Gewebe heraus.

Findet man während der Befundung ein 46,XY/46,XX Mosaik, kann von einer mütterlichen Kontamination ausgegangen werden. Mittels DNA-Heteromorphismus zwischen Mutter, Vater und 46,XX-Zellen der Kultur kann man einen Vergleich anstellen und die mütterlichen Zellen identifizieren.
Bei einem Karyotyp 46,XX kann die mütterliche Kontamination nicht erkannt werden.

· sie wird geringer, wenn während der Entnahme die ersten Milliliter der Amnionflüssigkeit verworfen werden
· sie wird geringer, wenn eine schmälere Punktionsnadel verwendet wird
· eine blutige AC erhöht das Risiko auf MCC
· die meisten MCC werden übersehen, wenn nur 1 Kultur gescreent wird oder weniger als 20 Zellen ausgezählt werden

· Mosaik:

Wird definiert als das Vorhandensein einer identen chromosomalen Abnormalität in mehr als einer Kultur.

In diesem Fall muss auf 30 Metaphasen ausgezählt werden, ist das Ergebnis danach immer noch unklar sollte weitergezählt werden.

Von einem Pseudomosaik kann gesprochen werden, wenn ein abberanter Karyotyp sich auf eine einzige Kultur beschränkt (Kulturartefakt).

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:: Quellenangabe

· The AGT Cytogenetics Laboratory Manual

Autor: M.J. Barch, T. Knutsen, J.L. Spurbeck
Jahr: 3. Auflage
Verlag: Lippincott-Raven
ISBN 0-397-51651-7

· ein Teil des Inhalts entspricht Erfahrungswerten des Humangenetischen Labors, SMZO Donauspital

Silvia Sladek, Petra Hofmeister
Biomedizinische Analytikerinnen
Langobardenstraße 122