Gewebekultur aus Lymphknoten

Für die zytogenetische Diagnostik der Leukämien, dem größten Anwendungsgebiet der Tumorzytogenetik, wird zumeist Knochenmark und/oder peripheres Blut verwendet. In diesen Fällen ist - abgesehen von einer eventuellen Separation über Dichtegradient - keine weitere Vorbehandlung nötig.

Peripheres Blut ist jedoch nur sinnvoll beim leukämischem Non Hodgkin Lymphom (NHL),
Knochenmark bei Knochenmarksbefall.

Bei den Non-Hodgkin-Lymphomen erweisen sich, so verfügbar, Tumorzellen aus befallenen Lymphknoten als geeignetstes Untersuchungsmaterial, das entsprechend präpariert werden muss.

In seltenen Fällen ergibt sich sogar die Notwendigkeit, Tumorzellen aus Exsudatflüssigkeiten (Pleura, Peritoneum) bzw. aus Proben von soliden Tumoren zu gewinnen.


Index

:: Zytogenetik aus Lymphknoten
:: Entnahme
:: mechanische Methode
:: enzymatische Methode
:: Fibroblastenkultur
:: Exsudatflüssigkeit
:: Quellenangabe

:: Entnahme

Den nativen Lymphknoten im OP in eine sterile Petrischale entnehmen und sofort in die Pathologie bringen, ehe er austrocknet. Dort wird mittels Makroskopie ein Stück Gewebe steril entnommen und in ein Kulturmedium mit Antibiotikazusatz übergeführt. Da das Gewebe für die eigentliche Kultivierung noch präpariert werden muss, ist ein Transportmedium wie RPMI-1640 ausreichend.

Die Zellen müssen für eine Einzelzellsuspension erst aus dem Gewebsverband gelöst werden. Dazu eignen sich je nach Gewebeprobe verschiedene Vorgangsweisen.

· Lymphknoten - lockerer Gewebsverband - mechanische Methode
· Solide Tumore - lockerer Gewebsverband (ähnlich Lymphknoten) des Tumors - mechanische Methode
· Solide Tumore - stabiler Gewebeverband – Fibroblastenkultur oder enzymatische Aufarbeitung

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:: Mechanische Methode

Metallsieb
© Sigma-Alderich Österreich

sterile Materialien

· Petrischale 10 cm Durchmesser
· Skalpell
· Pinzette
· Metallsieb (40 und 60 mesh(Siebstärke)) Sigma CD-1 (Cell Dissociation Sieve – Tissue Grinder Kit (siehe Foto)) - grobes Sieb immer über das feine Sieb legen
· Puffer
· Pipetten
· Röhrchen

Vorgangsweise

· das Metallsieb in die Petrischale setzen
· die Gewebeprobe zusammen mit ein paar Tropfen Puffer durch das Sieb drücken (bei großen Proben diese vorher mit dem Skalpell zerkleinern)
· Gewebsstück mit Pistill durchdrücken
· das Sieb von unten nachspülen
· die Zellsuspension in einem Röhrchen sammeln

Kulturansatz

in einer Gewebekulturflasche (Flask)

Zelldichte 2x10 hoch 6 / ml
Medium - MEM-Alpha + Mc COY'S 5A 1:1 mit 20% FCS (fetales Kälberserum)
Zusätze - Penicillin-Streptomycin, Vitamine, essentielle und nicht-essentielle Aminosäuren

Stimulation mit Calcium-Ionophor (5nM) A23187 + Phorbol-12,13-dibutyrat (500nM) ist möglich – ist bei befallenen Lymphknoten normalerweise nicht nötig

24 h Kultur

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:: enzymatische Methode

enzymatische Aufarbeitung für stabile Gewebeverbände (solide Tumore)

sterile Materialien

· Petrischale
· Pinzette
· Skalpell
· Schikanenkolben
· Magnetrührer + Rührkörper
· Gazefilter (Trichter mit Gaze auskleiden, autoklavieren damit steril)
· Sammelgefäß
· Enzymlösung
· PBS-Puffer
· Serum zum Stoppen der Reaktion

Enzymlösung 1
Hyaloronidase 5ug/ml
Collagenase 2ug/ml
DNAse 50 ug/ml

Enzymlösung 2
Trypsin-EDTA 0,25%

Vorgangsweise

· steriler Transport vom OP in die Pathologie, Entnahme eines Gewebestücks
· mit dem Skalpell in der Petrischale in kleine Stücke zerkleinern
· Gewebsstücke in Lösung 1 im Schikanenkolben 10 min rühren (bei Raumtemperatur)
· de Kolben zwischendurch immer wieder schütteln, um die Zellen zu lösen
· die Suspension in Lösung 2 überführen und 10 min rühren

· den Überstand durch die Gaze filtrieren und in das vorgelegte Serum abdekantieren
· verbliebene Stücke im Kolben kann man nochmals in Lösung 2 10 min rühren

ist der Gewebsverband sehr stabil in Lösung 1 über Nacht belassen

Reinigung der Zellsuspension

· Percoll in Pufferlösung, mit der Gewebssuspension überschichten
· zentrifugieren 7 min bei 25 g
· gereinigte Tumorzellen entnehmen
· 2x mit PBS-Puffer waschen und in Kultur bringen - mind 2 x 10 hoch 6 / ml

Ansatz in Gewebekulturflaschen (Flasks)

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:: Fibroblastenkultur

bei stabilen Gewebeverbänden, Hautstanzen oder Unterhautbiopsien von abortierten Feten

· aus dem Gewebe mit Skalpell kleine Stücke mit glatten Schnittflächen gewinnen (nicht zermörschern)
· Gewebekulturflasche (Flask) mit fetalem Kälberserum benetzen
· die Spitze einer Pasteurpipette unter sanfter Hitzeeinwirkung zu einem kleinen Haken biegen
· Gewebsstücke aufsaugen und in Abständen auf dem Boden des Flasks verteilen
· Flask etwa 20 Minuten senkrecht aufgestellt trocknen lassen
· den Flaskboden nur mit einer ganz dünnen Schicht Medium bedecken, sodass die Gewebeproben nicht abschwimmen

das Gewebe frühestens nach 4 Tagen (erstes Wachstum zu beobachten) füttern
regelmäßig Mediumwechsel durchführen

sobald ausreichend Wachstum vorhanden ist, die Zellen in eine neue Flasche trypsinieren
wenn ein dünner Layer, aber noch nicht zu dicht einen Mediumwechsel durchführen
24 h später ernten

eventuell Colcemid über Nacht einwirken lassen
die Zellen mit Trypsin ablösen
in einem Röhrchen fixieren und auftropfen

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:: Exsudatflüssigkeiten

Exsudatflüssigkeiten (Pleura und Ascites) liegen zwar bereits als Einzelzellsuspensionen vor, sind aber relativ zellarm. Daher das Exsudat in einem Plasmabeutel sammeln und für ein großes Zellpellet mehrmals zentrifugieren.

Kulturansatz entsprechend der Grunderkrankung (Leukämie, Lymphom)

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:: Quellenangabe

· Präparation und Kultivierung von Gewebeproben für die Zytogenetik

Vortrag am 3. Zytogenetik Forum Österreich, 12. November 2005

Elisabeth Krömer, Dr., KIMCL
Abteilung für Humangenetik
Medizinische Universität Wien
Währinger Straße 10
A-1090 Wien