Grundlagen Tumorzytogenetik

:: geschichtlicher Überblick ::

Die Anfänge der Tumorzytogenetik

Die Anfänge der Tumorzytogenetik reichen bis in das 19. Jahrhundert zurück: Der deutsche Pathologe David von Hansemann berichtete schon 1890 von auffälligen Kernveränderungen und gestörten Teilungsfiguren in Schnittpräparaten von Karzinomen.

Er vermutete, dass zwischen diesen Veränderungen und der Entstehung von malignen Tumoren ein Zusammenhang bestehen könnte. Etwa 25 Jahre später griff der deutsche Zoologe Theodor Boveri diese Vorstellungen auf und formulierte unter Hinzunahme eigener Beobachtungen die sogenannte "Chromosomenhypothese" der Tumorentstehung.

Danach werden Veränderungen im Chromosomensatz einer Zelle als Voraussetzung für den Übergang von normalem Wachstum zu maligner Proliferation angesehen.

Index

:: Anfänge
:: krebsfördernde Gene
:: Onkogene
:: Tumorsuppressorgene
:: Mutatorgene
:: Tumorzytogenetik
:: Diagnostik mit Bänderung
:: Diagnostik mit FISH
:: Diagnostik mit CGH
:: Quellenangabe
:: weiterführende Artikel

 

:: krebsfördernde Gene

In jedem Organismus sind zahlreiche Gene vorhanden, die das Zellwachstum steuern. Viele davon sind vor allem während der Embryogenese aktiv. Sie sorgen unter anderem dafür, dass sich während der Entwicklung zum richtigen Zeitpunkt bestimmte Zelltypen stark vermehren und ein Organ bilden.

Danach müssen diese Gene vollständig inaktiviert werden, damit ein geordnetes Wachstum des Organismus möglich ist. Zum Teil muss auch überschüssiges Gewebe wieder abgebaut werden, um komplexe Strukturen (z.B. die Finger der Hand) entstehen zu lassen. Dafür sind Gene notwendig, die das Zellwachstum hemmen und zum Teil auch einen streng kontrollierten Zelltod (Apoptose) auslösen.

Viele Gene, die an der Steuerung der Zellproliferation beteiligt sind, können im mutierten Zustand zur Krebsentstehung beitragen. Man unterscheidet heute drei Gruppen von Tumorgenen:

· Onkogene
· Tumorsuppressorgene
· Mutatorgene

:: TOP ::

:: Onkogene

Als Onkogene bezeichnet man Gene, die auf die Zellvermehrung so stark aktivierend einwirken, dass ein Tumor entstehen kann. Solange diese Gene nicht mutiert sind, sondern ihre normale Funktion zur richtigen Zeit ausüben, nennt man sie Protoonkogene.

Viele dieser Protoonkogene ähneln Virusgenen und man vermutet, dass sie irgendwann während der Evolution durch eine Infektion in die Keimzellen von Tieren gelangt sind. Sie wurden ins Genom integriert und übernahmen wahrscheinlich wichtige Steuerungsfunktionen für die Zellproliferation, weshalb sie bis heute erhalten geblieben sind. Viren können solche Gene auch wieder in sich aufnehmen und auf andere Organismen übertragen. Man kennt inzwischen weit über 50 verschiedene Protoonkogene, die durch Mutationen zu Onkogenen werden können.

Diese Mutationen entstehen auf sehr verschiedene Weise:

· Durch ionisierende Strahlen oder chemische Mutagene können Punktmutationen auftreten, die eine Veränderung der Basensequenz im DNA-Strang hervorrufen.

· Auch die Integration von Virus-DNA kann Protoonkogene aktivieren.

· Protoonkogene können sich auch vervielfachen und zu sogenannten Genamplifikationen führen. Dabei kann das Protoonkogen mehr als tausendfach auftreten. Durch die enorme Vermehrung der Gen-Kopienzahl kann das zugehörige Protein in sehr viel größeren Mengen produziert werden. Das ermöglicht auch ohne Veränderung des Einzelgens eine verstärkte Aktivierung der Zellproliferation.

Vor allem das MYC-Protoonkogen scheint besonders oft von Amplifikationen betroffen zu sein. Insbesondere bei Neuroblastomen, aber auch bei Lungenkarzinomen und vereinzelt bei Leukämien werden MYC-Amplifikationen beobachtet.

· Die Umwandlung von Protoonkogenen in Onkogene erfolgt vielfach auch durch chromosomale Umbauten (z.B. Translokationen).

Ein typisches Beispiel dafür ist die 9/22-Translokation, die bei der chronisch myeloischen Leukämie zur Entstehung des Philadelphia-Chromosoms führt. Bei dieser Translokation wird ein relativ großes Stück des Chromosoms 22 auf das Chromosom 9 übertragen. Im Austausch gelangt eine recht kleine Region des Chromosoms 9 in das Chromosom 22.
In dieser Region ist das ABL-Protoonkogen lokalisiert, das durch die Translokation in Chromosom 22 integriert wird. Dort verbindet sich das ABL-Protoonkogen mit dem BCR-Gen, wodurch ein Hybridgen entsteht. Dadurch wird ein Hybridprotein (Tyrosinkinase) gebildet, das die Proliferation eines bestimmten Zelltyps im Knochenmark verstärkt, so daß sich ein leukämischer Zellklon entwickelt.

Es gibt noch zahlreiche andere Beispiele für Protoonkogene im menschlichen Genom, die durch strukturelle Chromosomenveränderungen aktiviert werden.

:: TOP ::

:: Tumorsuppressorgene

Für eine geordnete Zellvermehrung sind nicht nur Gene wichtig, die durch mitoseauslösende Signale (z.B. Wachstumsfaktoren) die Proliferation bestimmter Zelltypen anregen. Ebenso notwendig sind Gene, die dafür sorgen, daß das Wachstum zur richtigen Zeit auch wieder beendet wird.

Auch von diesem Gentyp sind inzwischen im menschlichen Genom zahlreiche Vertreter bekannt. Solche wachstumshemmenden Gene können bei der Krebsentstehung ebenfalls eine sehr wichtige Rolle spielen. Wenn sie durch Mutationen deletiert oder inaktiviert werden, erlangen manche Zelltypen eine dauerhafte Teilungsfähigkeit und können dadurch zu Tumorzellen werden. Man nennt die wachstumshemmenden Gene deshalb auch Tumorsuppressorgene oder Antionkogene.

· In intensiven Forschungen hat sich gezeigt, dass Mutationen oder Deletionen eines Gens nicht genügen, um einen Tumor auszulösen. Zum Beispiel beim Wilms-Tumor müssen die WT-1 Gene in der Region p13 des Chromosoms 11 auf beiden homologen Chromosomen verändert sein, damit ein Tumor auftritt. Man nimmt an, dass eine Mutation in vielen Fällen familiär vererbt wird, während die zweite Mutation meist in Form einer Deletion durch eine strukturelle Veränderung eines Chromosoms 11 spontan entsteht.

Eine ähnliche Situation liegt im Chromosom 13 vor, wo das Tumorsuppressorgen RB1 in der Region 13q14 lokalisiert wurde. Wenn dieses Gen auf beiden Chromosomen 13 verlorengeht oder inaktiviert wird, entsteht in der Netzhaut ein Retinoblastom. Auch dieser bösartige Tumor tritt meist schon im frühen Kindesalter auf.

· Während die meisten Tumorsuppressorgene nur dann zur Tumorentstehung führen, wenn ihre beiden Kopien mutiert sind, ist die Situation beim p53 Gen deutlich anders:

Dieses Gen konnte auf dem Chromosom 17 in der Region p12-13 lokalisiert werden. Es ist ein wichtiges Wachstumsregulatorgen für viele verschiedene Zelltypen. Das entsprechende p53-Protein regt als Transkriptionsfaktor die Aktivität der RNA-Polymerase an und steuert damit die Genexpression. Außerdem ist es an der Steuerung des Zellzyklus beteiligt und ist für die Auslösung der Apoptose wichtig.

Das Protein ist recht kompliziert aufgebaut. Deshalb führen schon einfache Punktmutationen im p53 Gen dazu, dass der Aufbau des Proteins stark gestört wird und es deshalb nicht mehr seine normalen Funktionen ausüben kann. Inzwischen kennt man schon weit über 100 verschiedene Mutationen des p53 Gens, die fast alle zur mehr oder minder vollständigen Inaktivität des p53 Proteins führen. Da dieses Protein vielfältige Funktionen hat und das Wachstum in vielen Zelltypen steuert, kann seine Veränderung in den verschiedensten Geweben (z.B. Dickdarm, Lunge, Brust, Leber, Gehirn, Knochenmark) zur Tumorentwicklung beitragen.

:: TOP ::

:: Mutatorgene

Als Mutatorgene bezeichnet man Gene, die in die Replikation und/oder Reparatur der DNA eingreifen und damit für die Stabilität des Genoms wichtig sind. Es ist schon lange bekannt, dass Krebszellen oft eine starke genetische Instabilität aufweisen, die sich vor allem in zahlreichen numerischen und strukturellen Chromosomenveränderungen manifestiert.

Beim Dickdarmkrebs gibt es Hinweise auf Mutatorgene. Insbesondere bei der erblichen Form des Dickdarmkrebses, der ohne Bildung von Schleimhautpolypen entsteht (HNPCC-Syndrom), sind bisher 6 verschiedene Gene entdeckt worden, die durch Mutationen zu einer 100-1000fachen Steigerung der Gesamtmutationsrate im Genom führen, weil die DNA-Reparatursysteme gestört sind. Diese beim Menschen auf verschiedenen Chromosomen lokalisierten Gene haben eine erstaunliche Ähnlichkeit mit Mutatorgenen, die auch bei E.coli nachgewiesen wurden.

:: TOP ::

:: Tumorzytogenetik

Es dauerte eine Weile bis die technischen Voraussetzungen geschaffen waren, um die "Chromosomenhypothese" der Tumorentstehung zu überprüfen. Erst 1960 wurde mit dem sogenannten "Philadelphia-Chromosom" die erste Chromosomenanomalie gefunden, die für eine menschliche Leukämie als charakteristisch gelten konnte.

Philadelphia-Chromosom

Der Name wurde nach dem Ort gewählt, in dem die amerikanischen Forscher Nowell und Hungerford ihre bahnbrechende Entdeckung gemacht hatten: Sie entdeckten, dass in Knochenmarkszellen von Patienten mit chronisch myeloischer Leukämie sehr häufig ein kleines Chromosom auftrat, das normalerweise im menschlichen Chromosomensatz nicht zu finden war.

Das Ph-Chromosom blieb recht lange das einzige Beispiel für eine charakteristische Chromosomenanomalie, die bei einer menschlichen Tumorerkrankung so regelmäßig auftrat, dass man sie mit der Entstehung der Erkrankung in Verbindung bringen konnte. Die anderen untersuchten Tumoren wiesen meist so viele verschiedene Veränderungen des Chromosomensatzes auf, dass nicht feststellbar war, welche dieser Anomalien bei der Tumorentstehung eine Rolle spielten und welche nur Begleiterscheinungen des malignen Wachstums waren.

:: TOP ::

:: Diagnostik mittels Bänderungstechnik

Die Anwendung der Bänderungstechniken in der Tumorzytogenetik führte dazu, dass das Ph-Chromosom als ein verkürztes Chromosom 22 identifiziert wurde. Dabei zeigte sich aber auch, dass das am Chromosom 22 fehlende Stück nicht verloren geht, sondern an den langen Arm eines Chromosoms 9 transloziert wird.

Im Laufe der Jahre wurden mit verbesserten Bänderungstechniken eine Vielzahl von mehr oder minder spezifischen Chromosomenaberrationen entdeckt, die mit der Entstehung und Entwicklung von Tumoren beim Menschen in Zusammenhang stehen. Vor allem bei Leukämien und Lymphomen ergaben sich so charakteristische Chromosomenbefunde, dass sie zudem große Bedeutung für die Diagnose der verschiedenen Krankheitssubtypen erlangten.

Es zeigte sich, dass die zytogenetischen Befunde zum Teil wichtige Hinweise auf den Krankheitsverlauf liefern konnten. Beispielsweise wurde festgestellt, dass die typischen Fälle von chronisch myeloischer Leukämie (CML) mit Ph-Chromosomen eine wesentlich bessere Prognose haben als die wenigen Patienten, bei denen atypischerweise dieses Chromosom nicht gefunden wird.

Der Übergang der CML vom chronischen in ein akutes Stadium wird oft durch das Auftreten zusätzlicher Chromosomenanomalien (z.B. Trisomie 8, Isochromosom 17q oder zweites zusätzlichen Ph-Chromosom) angezeigt, lange bevor eine klinische Veränderung erkannt werden kann.

Bei akuter lymphatischer Leukämie (ALL) ist die Prognose besonders gut, wenn sich in den leukämischen Zellen eine Chromosomenzahl über 50 findet. Das Auftreten eines Ph-Chromosoms, das wie erwähnt bei CML einen relativ günstigen Verlauf anzeigt, führt bei ALL zu einer ungünstigen Prognose.

:: TOP ::

:: Diagnostik mittels FISH

Die FISH-Technik hat den großen Vorteil, dass man mit ihr chromosomale Umbauten erkennen kann, die mit den klassischen Bänderungstechniken oft nicht nachweisbar sind. Die Anwendung der normalen Bänderungsanalyse ist in der Tumorzytogenetik vor allem dadurch stark eingeschränkt, dass die präparierten Metaphasen oft eng zusammenliegende und stark kontrahierte Chromosomen enthalten, in denen kein klares Bandenmuster erkennbar ist.

In solchen Fällen kann mit den FISH-Techniken durchaus noch festgestellt werden, ob z.B. bestimmte Abschnitte eines Chromosoms fehlen oder verlagert wurden. Auch die Zusammensetzung sogenannter Marker-Chromosomen kann aufgeklärt werden. Soweit die entsprechenden Sonden zur Verfügung stehen ist es möglich die Amplifikation von Onkogenen bzw. den Verlust von Tumorsuppressorgenen oder Mutatorgenen nachzuweisen. In vielen Fällen lassen sich die FISH-Sonden sogar auf Interphase-Kerne anwenden.

Beispiel BCR/ABL

Weiters gibt es FISH-Sonden, mit denen man die bereits erwähnte 9/22 Translokation bei der chronisch myeloischen Leukämie (CML) nachweisen kann.

Philadelphiachromosom t(9;22)(q34;q11)

Betroffen sind am Chromosom 22 das Gen BCR und an Chromosom 9 das Gen ABL. Beide Gene fusionieren bei der Translokation, wodurch ein abnormes Fusionsprotein am Chromosom 22 entsteht. Abnorme Fusionproteine produzieren Wachstumsfaktoren (Thyrosinkinaseaktivität) – das bewirkt den Tumor. Medikamente können diese Aktivität stoppen oder mildern (z.B. Glivec, Her2-neu, EGFR), daher ist es so wichtig, die Translokation für die Behandlung der Leukämie nachzuweisen.

 

:: TOP ::

Methode BCR/ABL

· BCR/ABL dual color/single fusion probe

Eine grünfluoreszierende Sonde markiert das ABL-Onkogen, das in der Region 9q34 lokalisiert ist; eine rotfluoreszierende Sonde hybridisiert mit dem BCR-Gen auf dem Chromosom 22 in der Region q11. Die beiden Sonden werden vermischt angewandt.

Wenn zwischen beiden Chromosomen keine Translokation stattgefunden hat, findet man in den Interphasekernen jeweils 2 getrennte rote und grüne Fluoreszenzpunkte. Bei einer Translokation lagern sich ein roter und ein grüner Punkt aneinander, sodass ein einzelnes (single) Fusionssignal auftritt. Daneben finden sich noch jeweils ein getrenntes rotes und grünes Signal, die von den nicht an der Translokation beteiligten Chromosomen 9 und 22 stammen.

In der Metaphase liegt das Fusionssignal am langen Arm des betroffenen Chromosom 22 und am langen Arm des betroffenen Chromosom 9 fehlt das Signal.

· BCR/ABL dual color/dual fusion probe

Es handelt sich dabei um eine Mischung zweier Einzelsonden (grün und rot), die jeweils einen bestimmten Bruchpunkt überspannen (Dual color/dual fusion probe).

Es wird also eine einzige Sonde eingesetzt, wo die Signale für BCR und ABL bereits fusioniert sind. Bei einer stattgefundenen Translokation ist das Fusionssignal auf beiden translozierten Chromosomen zu finden, weil sich die markierten Regionen durch die Translokation aneinander angelagert haben. Die rot-grünen Fusionsignale liegen also auf Chromosom 9 UND auf Chromosom 22.

:: TOP ::

:: Diagnostik mittels CGH

Die CGH-Technik hat den großen Vorteil, dass man mit ihr Tumoren auf das Vorliegen von Chromosomenveränderungen untersuchen kann ohne dabei Metaphasen aus dem Tumorgewebe gewinnen zu müssen. Damit werden auch die vielen Tumoren einer Chromosomenanalyse zugänglich, bei denen keine Spontanmitosen auftreten und die auch in der Zellkultur keine Proliferation zeigen.

Außerdem besteht nicht die Gefahr, dass bei der zytogenetischen Untersuchung nur Metaphasen von Zellklonen erfasst werden, die sich in der Zellkultur besonders schnell vermehren. Allerdings ist das Auflösungsvermögen der CGH bisher noch begrenzt, weshalb nur das Fehlen bzw. der Zugewinn relativ großer Chromosomenstücke an Hand des Fluoreszenzprofils sicher nachgewiesen werden können.

Trotz dieser Einschränkungen in der Aussagekraft der CGH wurden damit schon zahlreiche interessante Ergebnisse bei einer Vielzahl menschlicher Tumoren erzielt. So konnte beispielsweise für humane Gliome nachgewiesen werden, dass die durch CGH erfassten genomischen Veränderungen mit der Tumorprogression deutlich zunehmen. Ähnliches gilt für Zervixkarzinome. Beim Mamma-Karzinom wurde festgestellt, dass insbesondere Zugewinne chromosomaler DNA im Bereich 8q eine schlechte Prognose anzeigen. Beim Prostatakarzinom zeigten sich ebenfalls Zugewinne im Bereich 8q vor allem bei Tumorerezidiven nach einer endokrinen Therapie. Auch bei vielen anderen Tumoren fanden sich in fortgeschrittenen Stadien DNA-Vermehrungen im Bereich 8q(11). Da dort das MYC-Onkogen lokalisiert ist, liegt die Vermutung nahe, dass eine Überexpression dieses Gens mit der Tumorprogression in Zusammenhang steht.

:: TOP ::

:: Quellenangabe

· Genmedizin - eine Bestandsaufnahme

Raem, A.M.; Braun, R.W.; Fenger, H.; Michaelis, W.; Nikol, S.; Winter, S. (Hrsg.)
Springer-Verlag
Ausgabe 2000

· Bedeutung der FISH bei Leukämien und Lymphomen

Vortrag beim FISH-Workshop Zytogenetik, 1. bis 2. April 2005

OA Dr. Michael Vesely
Facharzt für Pathologie und Humangenetik
Jakob Erdheim Institutu für Pathologie
Krankenhaus Hitzing (Lainz)
Wolkersbergerstraße 1, 1130 Wien

:: TOP ::

:: weiterführende Artikel

:: Floureszenz in situ Hybridisierung (FISH) ::
:: Comparative Genomic Hybridisation (CGH) ::
:: Peripheres Blut - Lymphozytenkultur ::
:: Leukämien und Lymphome ::